世界卫生组织《饮用水水质准则》明确提出:无论在发达国家还是在发展中国家，饮用水安全问题大多源于微生物污染，并将微生物问题列为首要问题[1]。特别是新冠肺炎疫情在全世界暴发以来，公众对影响健康的病原微生物更加关注[2]。如何快速检测水环境中(特别是饮用水源)的微生物污染，对于研究微生物在水体中的传播、归趋及潜在健康风险至关重要[3]。目前，中国水体中理化指标(如pH、溶解氧、高锰酸盐指数、重金属及部分有机污染物等)在线监测技术已经十分成熟，相关标准陆续出台[4,5]，在水质实时监测和污染预警中发挥着重要作用，但水环境中微生物的快速检测技术和在线监测预警技术尚处于发展阶段。环境水体中有些微生物(如一些真菌和细菌)能直接影响人们的身体健康，微生物对水体各种污染物具有高敏感性，水体中微生物监测可以实时反映水生态环境质量的真实状况。因此，快速掌握水体中微生物情况，开发和应用饮用水源中微生物实时监测及预警技术成为迫切需求。

平皿法、多管发酵法、滤膜法和酶底物等方法是中国检测水体中指示微生物的标准方法，其主要原理是借助培养、分离纯化和酶反应等技术手段对微生物进行定性和定量检测[6]。但微生物分离培养的方法不仅需要花费大量的时间和人力，而且自然界中能培养获得的微生物比例极小[7]，尚缺乏大多数微生物的突发性检测能力。分子生物学技术[8,9]和高通量测序[8,10,11]等技术在水体微生物检测中的应用(特别是结合微生物传感器[12]等检测手段的发展)，使水环境中微生物的快速检测和在线预警成为可能。

微生物检测新方法、各类便携式和在线检测设备的开发和技术集成正处于较快速的发展阶段。基于各种原理，开发灵敏度高、检出快、假阳性低、结果精准的微生物监测技术和设备有非常重要的意义。笔者综述了饮用水源微生物常用快速检测技术、潜在适用快速检测技术、新型快速检测技术的原理、设备研发以及应用现状，以期为水环境中微生物污染早期预警体系构建提供参考。

1、水体中微生物检测技术概述

传统的微生物检测方法在分析速度和性能上并不能满足饮用水源中微生物实时监测及早期预警的要求，与传统检测技术相比，微生物传感器等技术(表1)以其较好的选择性、更高的灵敏度、简便的操作性、低成本和可在线连续监测等诸多特点，在水体中微生物快速检测领域具有良好的发展潜力。但值得注意的是，尽管这些技术不需要对微生物进行培养，在测试所用时间上优于传统技术，但有些方法增加了水样浓缩、染色、生物大分子提取等前处理步骤，在一定程度上增加了样品总测试时间，也提高了它们的应用门槛。

2、微生物常用快速检测技术及其应用

微生物常用快速检测技术是现阶段已具备成熟理论和成套仪器设备应用的技术，主要通过微生物传感器靶向遗传物质(如核酸)、蛋白质或活细胞的其他组分(如三磷酸腺苷，ATP)来对微生物进行定性和定量检测。大多数用于检测微生物的传感器都是基于生物相互作用的，具有捕获或识别样品DNA、抗原等组分的功能，或是与样品组分直接相互作用。通常，将检测到的样品组分称为靶标，它是与捕获分子相互作用的实际分子(如特定的DNA序列、抗原和化学物质)，在某些情况下靶标可以指示整个生物体的存在。其中微生物传感器靶向靶标的特异性取决于捕获分子与指定靶标结合或相互作用的可靠性和牢固性。捕获分子-靶分子相互作用可以通过光的产生或质量变化等各种机制来对微生物进行定性和定量检测。传感器的灵敏度与捕获分子和靶标相互作用的程度以及在检测到反应之前需要相互作用的分子数量有关。一般情况下，检测过程中靶分子的结合和释放需要对靶分子进行浓缩，但在高浓度污染下，也可直接测量样品中的靶分子。目前，微生物常用快速检测技术及其应用主要有免疫测定、细菌-ATP测定、基于流式细胞仪的微流技术和生物颗粒监测仪-光散射技术，其测定原理和应用总结见表2。

2.1 免疫测定技术

自20世纪80年代初以来，免疫测定在临床、食品安全和环境微量污染物的质量控制中得到了广泛的研究和应用[44,45,46]。酶联免疫吸附测定(ELISA)和酶联荧光免疫测定(ELFA)是免疫测定中常用的方法。检测抗原-抗体反应是免疫测定技术的核心原理，将水体中的待测微生物作为特异性抗原，使其与相应的抗体结合后，通过检测样品中特定抗原蛋白与相应的抗体来定性和定量待测微生物。

免疫吸附剂的选择和使用是免疫测定技术的关键，用于捕获目标分子抗原或抗体作为免疫吸附剂(如一些特定的膜)固定在材料的表面[47]。通常，如果抗原被固定，样品中的靶分子是抗体，如果抗体被固定，靶分子则是抗原。当添加另一种识别样品抗原或抗体，称为二抗，也常用来作为免疫吸附剂。当测定由识别抗原的捕获抗体组成时，抗体又能被二抗识别，这种方法被称为抗体夹心测定法。第二抗体缀合(连接)于酶，其在底物存在下形成有色沉淀或发光，在酶分子催化的作用下，将成功结合且产生相互作用的信号放大，再进一步进行ELISA测定。通常，利用ELISA测定微生物需要在实验室的微量滴定板中进行识别和定量，随着计算机和电子芯片的发展，已将ELISA和ELFA的原理变化纳入微芯片设计中，并将免疫测定方法用于现场识别和筛选空气、食物和水的特定化学或微生物污染，该方法能在15min内确定特定微生物污染物存在情况。

2.2 细菌-ATP测定技术

ATP是用于食品和饮料行业中指示微生物存在的常见指标，由于ATP与微生物活动存在较好的相关性，该方法被开发应用于快速检测水中的微生物[48,49,50]。在荧光素酶催化下，酶和底物荧光素反应，分解ATP时释放光子，再用小型手持或便携式发光计测量反应发出的光量得出ATP浓度，根据ATP的浓度与样品中生物量的关系，通过测量发光量来表征样品中的生物量。利用细菌-ATP测定微生物需要购买光度计和特定耗材(酶、基质和样品容器等)，由于所有活细胞都具有ATP，且微生物中ATP的浓度与物种、菌株、环境和代谢因素有关，操作时需要分离微生物与非微生物ATP，通过过滤水样、清洗非细菌的ATP等方法达到目的。但是正在休眠的活细胞几乎不存在ATP，该方法无法测定休眠细胞的数量，且不能区分细菌种类。在水样中使用细菌加标方法，可以将检测限提高到约1000cfu/mL，利用腺苷酸激酶扩增可进一步提高细菌的检测限。目前细菌-ATP测定的检测限和干扰消除是该技术研究的重点[17]。

2.3 基于流式细胞仪的微流技术

流式细胞仪是20世纪60年代以来一直用于实验室细胞分析的通用技术，在医学和环境微生物群体分析中得到了广泛应用[51,52]。当激光束照射到单个细胞时，部分光撞击细胞内的物理结构，导致光线散射。利用检测器收集这些散射光并通过流式细胞仪的电子元件进行处理得到细胞信息[53]。通过添加荧光标记，根据光散射特性差异可进一步区分部分微生物。经荧光标记的单细胞分散悬浮液流过激光束(或多个激光束)，根据细胞大小、粒度、绿色荧光、红色荧光和远红色荧光强度差异可以识别每个细胞的性质。荧光标记可用于DNA、RNA、蛋白质(抗原)、其他特定细胞组分或靶分子，如将活细胞染色染料添加到样品中，通过流式细胞仪检测并区分活细胞和死细胞。将核酸嵌入染料可用于测定DNA和RNA比率及腺嘌呤-胸腺嘧啶/胞嘧啶-鸟嘌呤含量，可进一步表征样品中的细胞特点，开展微生物鉴定[17]。荧光标记可用于鉴定气溶胶、水、土壤和食物中的特定生物、毒素和病毒。

2.4 生物颗粒监测仪-光散射技术

光散射技术可提供特定尺寸颗粒信息的扫描程序[54]，是水体浊度测量时的常用技术[55]。将水体中的病原微生物看作特定尺寸的颗粒，当激光束通过流动水的时候，水中颗粒使激光束发生直角散射，利用光电二极管的光学装置收集散射光，通过分析散射光的信息来确定水样中存在颗粒的大小和数量。利用生物颗粒监测仪-光散射技术监测水中的颗粒能快速识别潜在的污染物，该技术方法克服了传统检测方法检测速度慢、工作强度大、高可变性和低回收率等不足。但是，该技术方法只能检测一定大小范围内的颗粒，并不能识别有关粒子特性的具体信息，从而无法区分该颗粒是沙粒还是病原微生物，导致该技术在应用时存在较高的假阳性率[17]。

3、微生物潜在适用快速检测技术及应用

随着计算机和仪器制造能力的发展，越来越多的检测技术和设备被研究出来，并与现有的成熟技术联合使用，丰富了病原微生物的检测手段。微生物潜在适用快速检测技术主要指一些可能适用于特定情况下水体微生物即时检测要求，但尚未商业化推广应用的技术。

3.1 基于光纤的生物传感器技术

美国海军研究实验室和英国研究国际公司开发了一种基于光纤的生物传感器技术，命名为RAPTORTM，它是一套便携式快速自动荧光测定系统[17]。该系统是集光学、流体、电子和软件于一体的独立结构，适用于生物污染物、毒素、爆炸物和化学污染物的实验室分析和现场监测。通过病原微生物在注塑聚苯乙烯波导表面上发生的单层受体-配体反应来鉴定特定病原微生物。RAPTORTM的便携式快速自动荧光测定系统可以在7～12min同时测完4种分析物，新一代的手持式产品能够对12～16个样品同步测定[23]。美国南佛罗里达大学DanielLim实验室将一套过滤(浓缩)系统与原型阵列生物传感器相连(基于光纤的生物传感器技术)，应用于饮用水自动连续在线监测。通过中空纤维过滤器对水样中微生物进行浓缩，再通过反冲洗将浓缩的微生物发送到生物传感器，从而识别水样中待测微生物[17]。

3.2 染料负载的微球技术

美国LuminexCorporation公司采用染料负载的微球技术开发了xMAP系统。该系统由直径为5.6μm的聚苯乙烯微球颗粒组成，这些微球颗粒载有允许100种不同颜色代码的红色和红外荧光团，且微球体涂覆单独的捕获分子，可以参与核酸杂交、抗体识别、受体-配体反应或酶促反应，最后微球通过检测室并进行光学测量。由于微球在溶液中的三维暴露接近溶解相动力学，反应时间比标准微阵列(扁平微阵列)快约3倍。美国劳伦斯利弗莫尔国家实验室(LLNL)的研究人员利用Luminex技术开发了一种自主病原体检测系统(APDS)[24]。该系统具有基于顺序注射分析的自动化样品制备模块系统，可连续自动工作[25]。

3.3 基于细胞的生物传感器技术

美国麻省理工学院开发了一种基于细胞生物传感器技术的抗原风险和定量细胞分析通告系统(CANARYTM)。该系统通过转基因B细胞表达针对靶抗原的抗体，当目标抗原存在于待测的样品中，转基因B细胞通过绿色荧光蛋白发光，可利用便携式发光计检测，但必须为每种靶抗原开发单独的细胞系。CANARYTM广泛应用于食品检测、动物健康、生物防御和人类健康护理等。

3.4 聚合酶链式反应技术

聚合酶链反应(PCR)是一种灵敏快速的分子生物学检测方法，其中，多重PCR技术在食品等领域病原微生物检测中应用已经较成熟[56]。PCR通过检测靶向核酸(DNA/RNA)来检测或鉴定生物，因此PCR技术可用于检测任何含有核酸的生物，包括病毒、细菌和原生动物，也适用于生物污染物的检测和识别[27]。该方法仅需要微升级别的样品，通过大量拷贝合成目标核酸物质，使用电泳、荧光基因探针和荧光熔解曲线等各种方法检测扩增的靶DNA。该检测方法具有选择性，可用于筛选选定的污染物，利用预包装试剂极大地提高了检测的方便程度。

但是，该方法不能区分活的和死的微生物，并且可能受到如土壤源性腐殖质和富里酸等自然干扰的负面影响。美国IdahoTechnologies开发了加固型高级病原体识别装置(RAPID)，被军方广泛使用，加入待测样品10～20μL，可以同时筛选8种病原微生物。最新的便携设备称为RAZOR，可以同时筛选12种病原微生物种[19]。此外，美国LLNL开发了基于实时PCR(TaqMan)的“手持式核酸分析仪”(HANAA)。操作者通过将试剂添加到反应管中并选择靶向病原体来检测样品，HANAA可在10min内识别出一种微生物[28]。

3.5 生物光电传感器系统

美国乔治亚理工大学应用传感器实验室的生物光电传感器系统可利用中红外区域光纤消逝波光谱来测量待测微生物与对应标记物的相互作用。生物光电传感器系统的传感区域涂有特定的薄聚合物层形成疏水膜，可在传感器表面附近富集疏水性分析物，降低对基质的干扰作用[29]。该传感器具有快速、高度灵敏等特点，能提供实时直接测量，无需额外步骤或消耗性试剂，并且能够检测空气和水中各种化学和生物样本[30]。

3.6 表面等离子体共振

生物分子间的结合能引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，利用生物分子间反应的变化来判断被检测物质的信息是一种潜在适用的技术。生物传感器芯片由涂有薄金层的玻璃支撑表面组成，通过各种方式修饰薄金表面用来固定不同的化合物。当样品通过芯片表面时，捕获与靶结合或相互作用的分子。蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物甚至全细胞与靶结合均可产生相互作用，结合时质量增加，解离时质量减少，通过检测质量变化产生样品中分子的动力学、亲和力和浓度等定量信息，该方法可以检测小至100Da的分子的结合。

美国Nomadics高级仪器组在便携式SPR平台上研发了特定化学和生物污染物的SPR评估模块。Nomadics评估模块基于得克萨斯州仪器公司的SpreetaTM生物传感器，可实现生物分子相互作用的实时定量测量。Spreeta的设计封装了整个SPR光学系统，使设备紧凑，并能够集成到各种仪器设计中。该传感器可用于检测和量化特定病原微生物的存在，用于农业、水质、医疗和食品安全等场景。斯坦福大学的研究人员测试了Spreeta并得出该传感器在实验室和临床环境中作为生物分析应用具有廉价、便携和准确等优点的结论[31]。研究指出该测试方法中的分析物浓度对应于90fmolIgG的检测[32]。

3.7 电化学发光

电化学发光(ECL)是利用氧化和还原钌金属离子产生的光作为标记系统的一种检测技术。当捕获分子(如抗体)被吸附在表面上(如磁珠或微阵列板)，从样品和钌化抗体中添加靶分子产生抗体夹心，刺激钌化抗体与电极一起发光时检测该抗体夹心的检测技术[17]，仅需要微升级别的样品便可进行ECL检测。美国BioVeriss的BioVerify测试利用2种识别病原体或毒素的抗体，一种固定在顺磁性微粒上，另一种用BioVerisBV-TAGTM标记物标记。将与抗体试剂混合的样品加载到基于流动的M1M分析仪中，并在测量池电极上收集，电极刺激BV-TATM标记(通过抗体和孢子)与微粒结合，并测量发射的光。M1M可测定肉毒杆菌神经毒素、大肠杆菌、沙门氏菌等。

4、微生物新型快速检测技术及应用

除前面介绍的微生物常用快速检测技术和潜在适用快速检测技术外，一些基于现有检测技术原理和应用的新型检测技术也得到了长足的发展(表3)。这些新型快速检测技术是传统免疫测定、概念验证和原型微芯片技术、微珠和光散射技术的进步和深入开发应用。这些技术的潜在应用范围是多种多样的，包括用于饮用水微生物监测的传感器。

5、总结和展望

计算机和仪器制造技术的发展促进了水体中微生物检测能力的提升，微生物快速检测技术在测量的灵敏度、精确度和稳定性等方面都取得了较好的成果。越来越多的研究机构加入微生物快速检测仪器设备的开发，一方面降低了微生物检测成本，另一方面促进了微生物快速检测技术的蓬勃发展。由于人们对饮用水安全的重视逐步提高，水源病原微生物的预警技术和设备仍然需要较多研发力量。建议今后微生物检测技术的发展重点为以下3个方面。

1) 将成熟的室内检测技术向室外发展，将瞬时采样监测向连续采样监测发展。建议重点发展免疫测定、细菌-ATP测定、流式细胞仪技术和PCR等技术在水源地生物监测的应用。

2) 加快构建微生物快速检测新技术、新方法的标准体系，包括增加重要指示微生物的监测指标以及对应的成熟监测技术。而微生物检测新技术和设备与现有标准方法的比对验证是微生物监测方法标准制定的重要手段。

3) 充分利用现有的大数据分析技术，有针对性地分析微生物指标之间的关联性以及对某些化学指标的指示性，提升微生物污染预警的数据处理能力。

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