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探究如何构建牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法

2020-07-08 216 上传者：管理员

摘要：为建立灵敏、快速、可视化的牛乳房炎金黄色葡萄球菌环介导等温扩增技术(LAMP),根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,分别优化反应条件和反应体系,进行特异性和灵敏度试验,并用优化后的方法对临床分离的金黄色葡萄球菌样品进行检测。结果表明,建立的方法可以在64℃反应60min,得到清晰的梯状条带;反应产物经10×SYBRGreenⅠ染色后,肉眼直接观察或是紫外线照射之后均可判定结果;敏感性试验表明,与常规PCR相比,该方法检测到的金黄色葡萄球菌最低浓度为1×101CFU/mL,灵敏度提高了100倍;该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应;31份临床分离的金黄色葡萄球菌样本检测的结果表明,该方法与传统的PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法特异性、灵敏度良好,可用于临床牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染的检测。

关键词：
nuc基因
微生物学
检测方法
环介导等温扩增
金黄色葡萄球菌
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金黄色葡萄球菌在自然环境中分布广泛,土壤、水甚至食物中都能检测出其存在,属于革兰阳性菌。该菌是条件致病菌,对于健康的人或动物无危害,但当机体处于免疫力低下等异常状态时便可能造成感染。金黄色葡萄球菌能够引起奶牛乳房炎、局部化脓性感染、交叉感染以及败血症、菌血症等全身性感染,严重时甚至引发奶牛败血症或脓毒血症而死亡,对奶牛安全以及社会公共卫生构成严重威胁,是重要的人兽共患病的病原之一[1,2]。目前,奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌最常用的检测方法仍然是通过细菌分离培养,但这种方法费时费力,在实际工作中不能满足其检测要求的高时效性。PCR、real-timePCR等分子生物学方法虽及时准确,但是对设备要求较高,不利于基层单位大范围应用,ELISA等免疫学方法虽然适用于基层多样本的快速检测,但是该方法同样受到灵敏度以及特异性的制约。环介导等温扩增技术由NotomiT等[3]于2000年首次设计并运用于病毒检测,因其独有的高效、准确、灵敏、经济、直观的特点,目前在众多病原检测领域得到广泛应用[4,5,6,7,8,9]。金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因的序列具有高保守、高特异性的特点,在众多临床分子检测方法如PCR、RT-qPCR等常被用作引物设计的靶基因[10]。本研究基于环介导等温扩增技术原理,针对金黄色葡萄球菌nuc基因片段设计一组特异性引物,建立并优化了金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法,并结合常见细菌检测其特异性以及灵敏性,建立一种可以用肉眼直接观察到的省时省力、经济高效的检测方法,为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的临床检测提供高效灵敏的手段。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和检测样品

大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌,西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存;31份临床奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌,本实验室从临床奶牛乳房炎乳汁中分离,经过细菌分离鉴定并保存。

1.1.2主要试剂

BstDNA聚合酶、硫酸镁(MgSO4)、10×Thermopolbuffer,NewEnglandBiolabs公司产品;甜菜碱,Sigma-Aldrich公司产品;SYBRGreenⅠ核酸荧光染料,北京索莱宝科技有限公司产品;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3仪器设备

PCR仪(K960),力康生物医疗科技控股有限公司产品;高速冷冻离心机(D3024R),美国贝克曼股份有限公司产品;立式压力蒸汽灭菌器(LS-50HJ),江阴滨江医疗设备有限公司产品;凝胶成像分析系统(GenoSens1800),北京赛智创业科技有限公司产品;电子天平(DTC),亚津电子科技公司产品;恒温水浴锅(HH-8A),北京科伟永兴仪器有限公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌高保守区域nuc基因序列(登录号:V01281.1),应用DNAStar软件进行序列比对,分析保守序列,并用PrimerExploreV5(https://primereexplorer.jp/)在线设计软件针对nuc基因的保守区核苷酸序列进行引物设计,得到5组引物,根据引物筛选原则进行筛选,得到外引物F3和B3,内引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2),引物由西安热默尔生物科技有限公司合成(表1)。

1.2.2核酸的抽提

按照细菌DNA提取试剂盒说明,获得金黄色葡萄球菌的DNA,溶解在ddH2O中,并使用微核酸分析仪测量DNA的浓度和纯度,将符合标准的样品储存在-20℃冰箱中备用。

表1金黄色葡萄球菌LAMP引物序列

1.2.3LAMP反应体系的建立与优化

以金黄色葡萄球菌DNA为模板,应用引物B3、F3及FIP、BIP进行LAMP扩增。25μL反应体系各组分浓度及构成分别为25mmol/L甜菜碱1.0μL,100mmol/LMgSO41.5μL,BstDNA聚合酶1μL(8U),10mmol/LdNTP3.75μL,10×Thermopolbuffer2.5μL,40μmol/LFIP/BIP均1μL,5μmol/LF3/B3均1μL,模板cDNA1μL,灭菌水10.25μL。

LAMP反应条件:反应时间(60、50、40、30min),反应温度(68、66、64、62、60℃);反应体系如下:dNTP浓度(1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L),内外引物浓度比(12∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1),分别对其进行优化,以确定最佳反应条件。

1.2.4特异性试验

分别以大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌核酸作为模板,以金黄色葡萄球菌核酸作为阳性对照,采用优化后的反应条件以及体系,检验该方法的特异性。

1.2.5灵敏度试验

用生理盐水对增菌后的金黄色葡萄球菌做10倍稀释,稀释8个梯度。经计数得知各梯度浓度为1×105CFU/mL～1×10-2CFU/mL,对不同浓度的金黄色葡萄球菌进行LAMP以及常规PCR扩增,进行灵敏性试验比较。

1.2.6LAMP可视化试验

在已优化的反应体系加入10×SYBRGreenⅠ1μL,置于64℃反应60min,反应后产物置于日光以及紫外光下分别进行观察。

1.2.7临床样品检测

分别用PCR和LAMP对31份临床金黄色葡萄球菌样品进行检测,比较两者的检出率。

2、结果

2.1引物特异性验证

用所设计的金黄色葡萄球菌外引物(F3+B3)进行常规PCR扩增,电泳结果显示(图1)获得与预期大小一致的230bp的扩增条带,PCR产物测序后与目的基因进行序列比对,同源性达100%,因此该PCR扩增条带即为目标基因。

2.2LAMP反应体系优化

优化结果表明,该方法最优体系为25μL,反应液含5μmol/LF3/B3均1.0μL,40μmol/LFIP/BIP均1.0μL,25mmol/LBetaine1.0μL,100mmol/LMgSO41.5μL,BstDNA聚合酶1μL(8U),10mmol/LdNTP5.0μL,10×Thermopolbuffer2.5μL,cDNA1.0μL,灭菌水9μL。反应体系于64℃扩增60min,产物经1.5g/L凝胶电泳出现梯状条带(图2)。

2.3特异性试验

使用沙门菌、大肠埃希菌和假结核棒状杆菌作为对照,在优化的条件下进行LAMP扩增。结果表明,仅在4号样本(金黄色葡萄球菌)中可电泳出梯形特异性条带(图3),反应产物经染色后于紫外灯下观察,可见仅有4号样本(金黄色葡萄球菌)出现绿色荧光,而其他扩增产物则为橙色;日光下,阳性产物(金黄色葡萄球菌)呈荧光绿色,而其他细菌呈无色或呈淡黄色。

图1LAMP外引物验证

图2LAMP反应体系及条件优化

图3金黄色葡萄球菌LAMP特异性试验

2.4灵敏性试验

对不同浓度的金黄色葡萄球菌进行LAMP以及常规PCR扩增,得到的结果见图4。所建立的LAMP方法对金黄色葡萄球菌的最小检出限为1×101CFU/mL(图4A),而常规PCR最小检出限为1×103CFU/mL(图4B)。由此可知,与常规PCR相比,本研究所建立的金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的灵敏性高出常规PCR100倍。

2.5临床样品检测

应用已经建立的金色葡萄球菌LAMP检测方法对31份奶牛乳房炎金色葡萄球菌菌液进行检测,并与常规PCR方法对比。结果显示,两者检测到阳性样品结果相同,表明LAMP与传统PCR方法特异性一致。

图4金黄色葡萄球菌LAMP灵敏性试验

3、讨论

环介导等温扩增技术是近20年发展起来并逐渐成熟的一种以恒温链置换为核心原理的核酸恒温扩增技术,由于其高特异性、高灵敏度、对设备要求低、可在短时间内将靶基因扩增109～1010倍[10]的高效性等优点,已广泛用于临床病原检测及基因筛选等众多领域。在金黄色葡萄球菌的检测方面,众多学者已经建立食品中以及实验动物中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法[7,8,9]。本研究以此为基础并改进引物设计方法,优化试验体系并建立金黄色葡萄球菌nuc基因的可视化LAMP检测方法。对试验体系优化结果表明,该体系在40min即可出现扩增条带,而在60min条带更亮且更清晰,因此以60min为该体系的最优时间,最优的温度同理。扩增结果受内外引物浓度比以及dNTP的浓度影响,当内外引物浓度比达到8∶1,dNTP浓度为2mmol/L时,扩增效果较好,电泳可见清晰梯状条带。灵敏度试验显示,建立的LAMP方法对金黄色葡萄球菌的最小检出限为1×101CFU/mL,而常规PCR最小检出限为1×103CFU/mL,表明所建立的LAMP方法较PCR具有高出2个数量级的灵敏性。特异性试验显示,建立的反应体系与沙门菌、大肠埃希菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应,仅对金黄色葡萄球菌可扩增出特异梯状条带,表明特异性良好,可用于临床检测。

在进行方法建立过程中,需要特别关注几个关键点。首先是选择合适的靶基因,由于细菌基因组庞大,结构复杂,因此在选择靶基因时应尽可能多的进行序列比对,筛选保守基因的保守区域,确保扩增的特异性以及稳定性。nuc为金黄色葡萄球菌所特有的耐热核酸酶基因,可保证反应的特异性,同时,该基因在菌种内变异程度低,保守性高,因而保证了反应的准确性以及稳定性。其次,该方法成功建立的关键在于引物的设计,在设计引物时需要同时考虑Tm值、GC含量、dG(引物末端的安定性)、引物之间的距离以及二级结构等对反应体系的影响,排除引物二聚体带来的非特异扩增。最后是确保试验分区,LAMP方法具有极高的灵敏度,在加样时极易混入气溶胶而导致反应体系污染,因而加样、反应、电泳等操作应各自独立分区进行,减少假阳性概率。此外,在加样结束后,反应开始之前用液体石蜡对反应体系进行液封是避免污染较为有效的方法。LAMP虽有众多还需完善的地方,但其明细的优势使其在病原检测领域已经有长足的发展,多种细菌、病毒、支原体、胚胎性别鉴定、肿瘤检测、原位扩增的快速LAMP检测方法已相继建立[11],同时,在众多学者的积极探索下,LAMP的新型扩增技术扩展至免疫、微流体、电化学发光、分子信标指示、多重实时、结合FTA卡的环介导等温扩增等领域,为LAMP的发展注入了新鲜血液[12]。

参考文献：

[1]杨国兴.多重PCR检测肉及肉制品中四种食源性致病菌的研究[D].河北保定:河北农业大学,2008.

[2]李彦媚,赵喜红,徐泽智,等.金黄色葡萄球菌引起食物中毒的作用机制与其耐药性的研究进展[J].现代生物医学进展,2011,11(14):2786-2792.

[4]何琳.环介导等温扩增技术快速检测水产动物病原的研究[D].浙江杭州:浙江大学,2012.

[5]秦海斌,温海,贺星亮,等.H3N2亚型犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用[J].动物医学进展,2019,1007-5038.

[6]刘志科,张洁,杨宁宁,等.沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用[J].动物医学进展,2018,39(3)10-14.

[7]谭震,李莎.可视化金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及应用[J].现代预防医学,2017(22):130-133.

[8]汪淼,杨文,刘学旭,等.实验动物金黄色葡萄球菌LAMP法快速检测[J].实验动物科学,2017(5):45-51.

[9]杨红.环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研究[D].河北保定:河北农业大学,2011.

[11]唐毕锋,马立业,曹广文.环介导等温扩增技术的应用和发展[J].实用医学杂志,2008,24(22):3972-3974.

[12]张亚平,郑志高,简保磊,等.新型环介导等温扩增技术开发与应用研究进展[J].分子诊断与治疗杂志,2018(2):138-144.

丛日华,金剑,徐滢,张琪,许信刚.牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及初步应用[J].动物医学进展,2020,41(07):11-15.