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膜表达IL-21的饲养层细胞对NK细胞体外扩增的影响

2024-10-08 107 上传者：管理员

摘要：目的:探究膜表达IL-21的饲养层细胞对NK细胞体外扩增的影响。方法:通过电转法构建膜表达IL-21的K562稳转细胞系,细胞灭活后与NK细胞共培养,观察NK细胞增殖情况。通过乳酸脱氢酶(LDH)和干扰素-γ(IFN-γ)释放实验检测扩增获得的NK细胞体外杀伤功能。构建NOD/SCID小鼠异种移植肠癌肿瘤模型,设置空白对照组、NK细胞组和扩增NK细胞组,检测扩增NK细胞体内肿瘤杀伤功能。结果:通过电转法成功构建了膜表达IL-21的K562细胞。与膜表达IL-21的K562细胞共培养17 d后,NK细胞的扩增倍数可达700倍,与对照组相比扩增能力明显增强(P<0.001)。体外肿瘤细胞杀伤实验检测结果显示,NK细胞和扩增后的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用无明显差异,对小鼠体内肿瘤的杀伤效果也无明显差异。结论:膜表达IL-21的K562细胞可显著增强NK细胞的体外扩增能力,但不影响NK细胞的体内外杀伤功能,可用于后续NK细胞的体外规模化扩增。

关键词：
K562细胞
NK细胞
体外扩增
白介素-21
自然杀伤
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自然杀伤（NK）细胞因具有独特的生物学特性、对肿瘤的细胞毒性、治疗安全性，在肿瘤免疫细胞治疗中备受关注[1]。但NK细胞属于较难扩增的免疫细胞，来源不足极大限制了NK细胞疗法的应用，如何体外高效扩增有活性的NK细胞是急需解决的难题之一[2]。目前常用的扩增方法有细胞因子刺激法、包备法、饲养层细胞共培养法等。其中K562细胞作为抗原提呈细胞已被证明可以提供细胞接触依赖性的共刺激信号，增强NK细胞的扩增[3-5]。并且K562细胞作为饲养层细胞扩增的NK细胞输注已经通过临床测试，被认为可以安全用于患者的免疫治疗[6-8]。而通过白介素（IL）等外界因子的刺激作用，同样可以促使NK细胞自我复制和增殖，数量不断增长[9-11]。研究发现，IL-21可协同其他免疫因子促进外周血中NK细胞扩增，IL-21与NK细胞的增殖和成熟有关[12-13]。由此推测利用基因编辑构建膜表达IL-21的饲养层细胞将进一步促进NK细胞的体外扩增。本研究拟构建膜表达IL-21的K562稳转细胞系，通过共培养评估其对NK细胞体外扩增的影响，并检测扩增所得NK细胞的体内外杀伤活性。

一、材料与方法

试剂与仪器

K562细胞系源自本实验室传代保存，NK92细胞系购自北京百奥思诚生物科技有限公司，RPMI 1640、PS、FBS和PBS均购自美国Gibco公司，Myelo Cult H5100购自加拿大Stemcell公司，CD56 PE-cy7抗体、CD3 APC抗体、NKG2D APC抗体、KIR APC抗体、NKP44 APC抗体、NKP46 APC抗体均购自美国BD公司，RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司，二氧化碳恒温细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司，倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，实时定量PCR仪购自美国BioRad公司，低速离心机购自日本久保田公司，Count star智能细胞分析仪购自上海艾力特生命科学有限公司。

K562细胞系的转染

使用Lonza Nucleofector 4D电转法建立膜表达IL-21的K562细胞系，重悬K562细胞并进行细胞计数，用100μl电转液重悬2×106K562细胞，然后加入电极杯中，将质粒加入电极杯底部，设定电转仪程序：FF-120，电转完成后，将细胞种进先前预热的K562细胞培养基中，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养并隔天更换新鲜培养基，当细胞生长密度达到70%后进行传代，将细胞以1×106/孔的密度接种于新的孔板中继续培养。

丝裂霉素（MMC）预处理K562细胞系

每孔以1×106/ml密度接种K562细胞系，每组按照不同的浓度梯度进行处理，每组各3孔。晃匀后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，处理K562细胞2.5 h。用PBS洗5遍，270×g离心5 min，弃掉上清，细胞计数保证每孔1×106细胞，晃匀后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，培养3 d，每天取每组不同细胞进行计数和活性检测，最终选取适合的MMC浓度进行K562细胞系的预处理。

NK92细胞与K562细胞系共培养

d 1用含NK92细胞培养基重悬NK92细胞，细胞密度调整至1×105/ml，加入用MMC处理后的饲养层细胞，晃匀后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；d 3将上述细胞以190×g离心5 min，弃上清后用NK92细胞培养基重悬沉淀，一传二进行传代，晃匀后于37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养；d 7再次加入用MMC处理后的K562-mb IL21饲养细胞作为刺激。每3 d进行换液传代计数，一直到d 17为止。

流式细胞术检测NK92细胞表面标志物

收集共培养后d 6细胞，190×g离心5 min，用1 ml PBS重悬，进行细胞计数，细胞计数后将细胞密度调整为1×106/100μl，按每管细胞悬液加4μl的比例添加相应NK细胞流式抗体后，在4℃冰箱内避光孵育30 min，然后每管添加1 ml PBS清洗细胞2次，190×g离心5 min，去掉上清，最后用300μl的PBS进行重悬，再使用100μm滤网过滤到96孔板内，使用流式细胞仪进行流式检测。

乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测扩增后NK92细胞的体外肿瘤细胞杀伤功能

取预先准备好的NK92细胞、扩增后的NK92细胞以及目标癌细胞按照不同的效靶比（1︰1、5︰1、10︰1、15︰1、20︰1）置于96孔板中，把板放入37℃、5%CO2孵箱内共培养过夜。向癌细胞最大LDH释放组、培养基最大释放组、培养基背景组中每孔加入10μl细胞裂解液，轻轻混匀，然后把板放入孵箱内45 min。取出96孔板，200×g离心2 min。离心结束后，用排枪从96孔板每孔中小心吸出50μl上清液转移至新的96孔板内，再向96孔板内每孔加入50μl底物混合液，室温避光孵育30 min，加入终止液终止反应，并用分光光度仪读取490 nm处的吸光值。

干扰素γ(IFN-γ）释放实验检测扩增后NK92细胞的体外肿瘤细胞杀伤功能

将扩增后的NK92细胞以及正常NK92细胞和目标癌细胞按不同效靶比（1︰1、5︰1、10︰1）置于96孔板中。共培养过夜后，吸取100μl上清样品备检测。取出酶包被的试剂盒中孔板，依次加入100μl各组共培养后的样品、NK92细胞对照和不同浓度标准品。确保15 min内加完混匀，盖上试剂盒中贴膜，常温孵育2 h，洗4次。加入50μl终止液，30min内读取450 nm的吸光值。

构建结肠癌NOD/SCID小鼠异种移植肿瘤模型，验证扩增后的NK92细胞体内肿瘤杀伤效果

实验动物

NOD/SCID小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物质量合格证号：SCXK(京)2021-0006。所有实验小鼠饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心SPF级层流实验室，实验动物饲养设施合格证号：SYXX(军)2017-0023。

模型制备

预先消化LS174T细胞，获得LS174T细胞悬液，计算好需要的细胞数量（每只小鼠需要1×105细胞）。然后添加等体积的基质胶。选取6-8周雄鼠18只，待麻醉小鼠后，用100μl微量注射器吸取适当的LS174T基质胶细胞悬液，将细胞注射到小鼠背部皮下，通过注射皮丘建立LS174T细胞系异种移植小鼠模型，待肿瘤成型后，按治疗随机分为对照（尾静脉注射PBS）、NK92细胞治疗（尾静脉注射NK92细胞治疗）、扩增后的NK92细胞治疗（尾静脉注射扩增后的NK92细胞治疗）共3组，每组6只，治疗组每只小鼠注射1.5×107细胞，每组每周尾静脉注射1次，4周后观察肿瘤大小变化。

统计学分析

使用Graph Pad Prism 8软件对实验数据进行整理并分析。实验数据以x±SD表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两个独立样本之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

K562-mb IL21细胞系的构建

本研究构建了mb IL21的载体质粒（图1A-B），通过Lonza Nucleofector 4D电转法建立膜表达IL-21的K562细胞，明场观察电转后细胞仍保持聚团生长的特性，荧光显微镜下观察到电转质粒GFP阳性表达（图1C-D）。采用RT-q PCR检测其IL-21基因的表达情况，结果显示IL-21在电转后的K562细胞中表达显著增加（P<0.001）（图1E）。Western blot检测正常K562细胞和转染K562-mb IL21细胞的IL-21蛋白质水平的表达，包括正常K562细胞2组，电转后的K562-mb IL21细胞2组，结果提示转染K562-mb IL21细胞IL-21蛋白均较高表达（图1F）。

确认K562细胞与NK92细胞的共培养比例

首先确定MMC溶液处理K562细胞的合适浓度，本研究设置终浓度为5、10、15、20μg/ml MMC溶液，处理K562细胞2.5 h，计数培养1、2和3 d的细胞数（图2A）。相比之下，10μg/ml作为MMC溶液的最终浓度时，K562细胞的数量相对稳定，细胞形态也比较稳定，绝大多数细胞仍呈圆形（图2B）。因此，选择该浓度作为MMC的最佳处理浓度。进一步确定K562细胞与NK92细胞共培养比例，分别以1︰1、2︰1、3︰1、4︰1、5︰1、6︰1这6个不同的共培养比例进行6 d的培养，结果显示以2︰1的比例进行共培养时，细胞的活性较好（图2C），细胞形态也保持着圆形轮廓，胞质透亮（图2D），因此确定K562细胞与NK92细胞以2︰1的细胞数量比例进行后续的共培养实验。

K562-mb IL21细胞对NK92细胞的作用

本研究设置了3个培养组，实验组为K562-mb IL21细胞与NK92细胞共培养，对照组为正常K562细胞与NK92细胞共培养，空白对照组为单独NK92细胞培养。共培养17 d，每3 d进行换液并计数细胞，收集实验组共培养d 6的细胞，使用流式细胞仪进行流式检测，结果显示，其CD56、NKP44、NKP46、NKG2D、KIR的表达与正常NK92细胞相比没有明显差异（图3A）。经过17 d的共培养，对各组细胞数量进行统计分析，可以观察到，在10d前NK92细胞数量增长不明显，呈缓和趋势，在d 10后，差异逐渐显现出来，在K562-mb IL21细胞的刺激下，NK92细胞的数量在d 17增长为原来的700倍，与空白对照组相比，其扩增能力明显增加（P<0.001），并且优于正常K562细胞刺激的NK92细胞扩增数量（P<0.01）（图3B）。

针对结直肠癌细胞系体外杀伤的LDH、IFN-γ释放实验

为了验证扩增后的NK92细胞对肿瘤细胞系是否依旧保持杀伤能力，本研究设置了LDH和IFN-γ释放实验，分别对SW116、SW837和Caco-2这3种结肠癌细胞进行杀伤实验检测，结果显示，扩增后的NK92细胞和正常NK92细胞对于这3种结直肠癌细胞系均有杀伤作用，且这种杀伤作用随着效靶比的提高而逐渐增强（LDH释放实验：rExpanded NK92 cells=0.988 8,0.998 9,0.988 3;rNK92 cells=0.995 2,0.996 6,0.987 7;IFN-γ释放实验：rExpanded NK92 cells=0.974 4,0.998 5,0.994 2;rNK92 cells=0.987 2,0.999 9,0.999 6），但两者对不同肠癌细胞系的杀伤作用无显著统计学差异（图4）。

针对结直肠癌细胞系的体内杀伤作用

为了更具体化地观察扩增后的NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，本研究设计了小鼠荷瘤实验。通过比较治疗前后小鼠活体成像观察肿瘤大小（图5A），可以看到空白对照组肿瘤明显增大，扩增治疗组肿瘤对比空白组略微有缩小，对比荧光强度分析显示有统计学差异（P<0.05），而注射NK92细胞悬液治疗组和注射扩增NK92细胞治疗组相比无明显统计学差异（图5B）。在第四周末（28 d）处死荷瘤小鼠，并解剖小鼠肿瘤，对比观察不同治疗组肿瘤的形态大小（图5C）。3组小鼠肿瘤从形态上看差异不是很大，但是相比空白治疗组，扩增NK92治疗组在肿瘤形态体积上略微有些缩小。统计分析不同治疗组小鼠肿瘤的重量，可以看到肿瘤重量有下降趋势，扩增NK92细胞治疗组对比空白治疗组有统计学差异（P<0.05）（图5D）。

三、讨论

NK细胞占外周血淋巴细胞的5%-10%，是先天免疫系统的重要组成部分，在抵御病原体和癌细胞的一线防御中发挥着关键作用，具有消除因病毒感染或恶性转化而受损的异常细胞的天然能力[14]，但来源不足以及数量不够是NK细胞应用于临床的一大障碍[15]。虽然目前可通过多种方法诱导获得NK细胞[16]，但扩增数量和纯度仍无法满足临床上的多次输注需求。随着研究进展，人们通过抗原提呈细胞来刺激NK细胞的增殖，并且可以通过基因编辑，使抗原提呈细胞表达促进NK细胞活化的配体，通过与NK细胞接触，进一步激活NK细胞的活化信号通路，实现大规模的扩增。目前已有不少成功的案例，比如mb IL-15、mb IL-4-1BB等[17-18]，可以大规模扩增NK细胞，但在临床应用上往往会发生输注反应，甚至会增加发生急慢性移植物抗宿主病的风险[19]。而mb IL21扩增的NK细胞在I/II期临床试验中得到了很好的治疗效果，并且患者几乎没有发生相关的副作用以及肿瘤复发[20]。因此，利用膜融合IL-21的K562细胞促进NK细胞扩增会是一个很好的选择。

本研究成功构建了K562-mb IL21细胞，在明确两种细胞的最佳共培养比例后，对比正常K562细胞共培养组和单独的NK92细胞组，与K562-mb IL21细胞共培养的NK92细胞在第17 d扩增为原来的700倍，表明K562-mb IL21饲养层细胞会促进NK92细胞的体外扩增。流式结果显示，扩增所得的NK细胞表面受体（CD56、NKP44、NKP46、NKG2D、KIR）表达比例同样能维持正常生理状态。体外细胞LDH杀伤实验和IFN-γ释放实验显示扩增后的NK92细胞对3种结直肠癌细胞系均有杀伤作用，与正常NK92细胞无显著统计学差异。体内小鼠结肠癌杀伤实验同样显示扩增所得NK92细胞可达到与正常NK92治疗组相同的肿瘤杀伤效果，抑制肿瘤生长，并且扩增组的杀伤效果较好。

综上所述，本研究证实K562-mb IL21细胞会进一步促进NK细胞的扩增但不影响NK细胞的杀伤功能，后续将开展K562-mb IL21细胞对不同来源NK细胞的扩增作用，为未来体外大规模扩增高活性、高纯度NK细胞提供基础。

基金资助:广东省重点领域研发计划资助项目(2021B0101420005); 广东省胃肠肿瘤精准医学重点实验室(2020B121201004); 广东省重点人才项目(2019JC05Y361); 广州市科技计划项目(202206011130280011); 广东省自然科学基金(2018A030313537);

文章来源:徐振钊,张学华,赵玲萍,等.膜表达IL-21的饲养层细胞对NK细胞体外扩增的影响[J].中国实验血液学杂志,2024,32(05):1578-1584.