镁离子是生物体细胞中最丰富的二价金属离子，对大多数生物体的生命活动都是至关重要的，其在细胞生命周期中参与了体内生物分子的合成、折叠和稳定[1, 2]。在人体细胞中，镁离子在心率、血压、神经肌肉传导、骨骼生长及葡萄糖代谢维持方面发挥重要作用[3]。镁离子是生物膜与基因组稳定所必须的离子，生物体中有超过600种酶需要镁离子才能发挥其活性[4]。镁离子和许多人类疾病相关，包括恶性肿瘤、癫痫、帕金森病、T细胞免疫缺陷及糖尿病等[4]。研究表明，细胞周期蛋白家族（CNNMs）是近些年被发现参与镁离子跨细胞膜转运的蛋白质[5, 6]，他们最初被命名为“古代保守结构域蛋白”，但现在通常被称为细胞周期蛋白“CNNM”[7]。已知的4个成员细胞周期蛋白1-4（CNNM 1-4）在序列和结构方面均有着明显的相似性，但其表达模式在不同的组织和器官中存在显著差异[6, 8, 9]。其中CNNM1主要存在于大脑内，通常作为细胞质内的铜离子伴侣[10]；CNNM2的突变与脑畸形、精神分裂症及癫痫密切相关[6, 11, 12]；CNNM3主要在心脏中表达；而CNNM4主要存在于大脑、骨髓及免疫系统内[13]。其中CNNM2和CNNM4通常被认为介导着肾脏和肠上皮内基底侧镁离子的外排，且CNNM2和CNNM4具有59.98%的蛋白序列同源度[14-16]。CNNM4是肿瘤细胞病理过程中生物能量物质的转运基础[15, 17]。研究证实，CNNM4可以作为细胞内镁离子的感受器，通过交换细胞内镁离子和细胞外钠离子的方式从而对细胞内的镁离子进行外排[18, 19]。CNNM4的敲低会使细胞内镁离子浓度增加，从而产生对肿瘤生长有利的环境，因此CNNM4的表达水平与肿瘤的恶性程度呈负相关[15]。除此以外，CNNM4可以和肝再生磷酸酶家族中的PRL1/3相互作用形成复合物（CNNM4-PRL1/3），而CNNM4-PRL1/3的复合物会抑制镁离子的外排，使得细胞内镁离子浓度升高，从而有助于形成对于肿瘤生长有利的环境，促进肿瘤细胞的生长和转移[15]。同时CNNM4是细胞周期蛋白家族中对镁离子外流活性影响最大的一种亚型[20]。因而深入研究CNNM4对于解释肿瘤发生发展中镁离子相关的分子机制，以及靶向抗肿瘤药物的设计和研发具有重要的临床和现实意义。同时由于CNNM4与CNNM2结构及序列的高度相似性，对于CNNM4的研究也将对CNNM2引起的神经系统疾病具有重要的参考意义。

1、材料与方法

一、实验材料实验自2022年8月至2023年3月在中国人民解放军空军军医大学第一附属医院神经外科实验室完成。1.细胞系：使用人胚肾细胞293F（Hek 293F）及昆虫细胞SF9，并在本实验室内传代保存。2.实验试剂及来源：感受态细胞DH5α、感受态细胞DH10Bac（北京博迈德公司）；细胞培养基SMM293TI（北京义翘）；胎牛血清（四季青）；青霉素/链霉素（赛默飞）；去垢剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷（β-DDM）、胆甾醇琥珀酸酯（CHS）（Anatrace）；质粒提取试剂盒（TIANGEN）；Flag beads（Genscript）；细胞培养基SIM SF（北京义翘）。3.主要仪器：超速离心机（Beckman XPN-100）；恒温孵箱（Thermo 371）；洁净工作台（苏净集团安泰公司）；生物安全柜（西班泰克公司BSC-1200II A2）；多功能电泳仪（Bio-Rad）；蛋白纯化系统（CytivaATKA pure）；紫外分光光度计（杭州米欧仪器）；超纯水制备系统（青岛普洛斯）；摇床（杭州米欧仪器）。二、实验方法1.细胞培养（1）复苏：将冻存的Hek 293F细胞在37℃水浴锅中融化解冻，轻轻摇晃冻存管，使其受热均匀；在无菌超净工作台内将解冻完成的细胞小心转移至200 ml细胞培养瓶中，加入含2%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的SMM-293TI细胞培养基约50 ml，轻轻摇晃混匀。将复苏后的细胞放置在37℃、120 r/min、8.0%CO2恒温孵箱内的摇床上培养。（2）传代：293F细胞约48 h增殖1倍，约每2 d处理1次。当细胞需要传代时，在无菌超净工作台内将悬浮细胞轻轻震荡混匀，取少许细胞悬液进行计数，用含血清及青、链霉素的SMM-293TI培养基调整细胞浓度为（1~1.5）×106/ml，细胞悬液总体积不超过培养瓶总容量体积1/3，继续培养。2.CNNM4序列合成：见图1。

图1 CNNM4序列合成

3.病毒制备：

CNNM4质粒使用DH5α感受态细胞进行转化、扩增，用质粒提取试剂盒提取后于-80℃保存；使用菌株DH10Bac感受态细胞制备Bacmid。SF9细胞在25℃的SIM SF（Sino Biological lnc）培养基中培养。在SIM SF培养基中添加2%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素，在SF9细胞中产生扩增病毒。根据说明使用X-tremeGENE 9 DNA TransfectionReagent试剂转染Bacmid。将SF9细胞浓度调整至（1~1.2）×106/ml，使用无血清、无双抗的SIM SF培养基调整细胞浓度。给细胞培养瓶分类标记，分装密度为3 ml 1×106/ml SF9细胞；分别取20μl Bacmid与100μl无血清培养基混合，静置5 min，取20μl转染试剂与100μl无血清培养基混匀，静置5 min；再将混合好的Bacmid与混合好的转染试剂混合，静置20 min；将以上混合好的试剂轻轻滴加至调整细胞浓度后、体积为3 ml的SF9细胞中。转染后第2~3天，观察细胞状态，细胞平均直径变大，活率>80%；转染后第4~5天，观察细胞状态，细胞平均直径变小，活率降低，在活率<50%时将细胞转移至离心管中，室温3 600 r/min离心3 min，弃沉淀后收获上清即为P0代病毒，于4℃避光保存。后用P0代病毒制备P1代病毒：准备50 ml密度为1×106/ml的SF9细胞，加入500μl P0代病毒进行培养，观察细胞直径及活率，在活率<50%时，弃沉淀收获上清即为P1代病毒，于4℃避光保存。后用P1代病毒制备P2代病毒：准备200 ml密度为1×106/ml的SF9细胞，加入2 ml P1代病毒，观察细胞直径及活率，活率<50%时收获上清即为P2代病毒，弃沉淀收获上清即为P2代病毒，于4℃避光保存。

4.蛋白表达：

选择Hek 293F细胞进行蛋白表达。Hek 293F细胞在37℃的SMM293-TI培养基中培养，在SMM 293-TI培养基中添加2%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素；取Hek 293F细胞调整细胞密度为（4~6）×106/ml，体积为400 ml，加入CNNM4 P2代病毒25 ml，在37℃、120 r/min、8%CO2环境中培养16 h后加入10 mmol/L丁酸钠，培养48 h后收集Hek 293F细胞（3 600 r/min离心10 min），弃上清，使用TBS（30 mmol/L tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）清洗细胞，将细胞轻轻悬起，3 600 r/min离心15 min，弃上清获得细胞，液氮速冻之后将细胞于-80℃冻存备用。

5.蛋白纯化：

将冻存的细胞取出，置于常温解冻，使用2倍细胞体积缓冲液TBS（30 mmol/L trisHCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl）悬起细胞沉淀，使用超声破碎仪将细胞悬液在冰上超声破碎10 min（工作5 s暂停5 s），观察细胞悬液状态，确认无结团、沉淀后转移细胞悬液至干净的50 ml离心管内，加入去垢剂1%β-DDM+0.2% CHS混合，置于4℃环境中旋转混匀进行溶膜1 h。1 h后取出离心管，转移溶液至超速离心机专用离心管内，配平，40 000 r/min、4℃ 离心1 h。离心完成后取出离心管，弃沉淀，转移上清至干净的50 ml离心管内，加入Flag beads250μl，置于4℃环境中旋转混匀、结合1 h后取出。将混合溶液倒入亲和层析重力柱内流下，重复2次，尽可能多地将Flag beads留在柱内。使用TBS+0.01%β-DDM+0.002% CHS 5 ml对beads进行清洗，摇晃混匀后静置10 min流下，再加入5 ml清洗后直接流下。配置洗脱液1 ml：Flag peptide溶于TBS+0.01%β-DDM+0.002% CHS中，调整洗脱液终浓度为0.4 mg/ml。取600μl洗脱液混匀后加入重力柱中，尽可能覆盖所有beads，静置10 min后流下，收集至1.5 ml体积的EP管内，再将收集到的洗脱液重新加入柱中，直接流下，重复2次，收集所有液体。高速离心机12 000 r/min、4℃离心30 min去沉淀，转移洗脱液至新的EP管内；继续使用高速离心机12 000 r/min，4℃离心10 min去气泡。使用蛋白纯化系统（CytivaATKA pure）进行凝胶过滤层析（层析柱规格Superose6 increase）。

6.使用Alpha Fold 2对CNNM4进行结构预测：

Alpha Fold 2是由DeepMind开发的一项基于人工智能的蛋白质结构预测方法，可以通过同源蛋白质的信息和多序列比对预测蛋白质结构[21]。目前Uniprot数据库中已有通过Alpha Fold 2预测的人源CNNM4结构模型，通过Uniprot数据库获取人源CNNM4的AlphaFold 2预测结构并进行分析，网址https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q6P4Q7/entry#structure。

2、结 果

一、CNNM4蛋白质的克隆、表达和纯化

CNNM4蛋白质包含775个氨基酸残基，分子量为86 607 Da。将CNNM4蛋白质的基因构建至pEGBacMam真核表达载体中，并在C末端融合Flag标签。之后利用该质粒制备病毒杆粒Bacmid，在SF9细胞中包装和扩增病毒，之后用该病毒感染Hek 293F细胞进行表达，使用去垢剂β-DDM+CHS进行抽提，经过Flag-tag进行亲和层析得到纯度较好的CNNM4蛋白质样品。CNNM4蛋白质的凝胶过滤层析结果显示：CNNM4蛋白质均一性良好，SDS-PAGE表明CNNM4蛋白质纯度较好，纯度可达到90%以上，见图2。

图2 CNNM4凝胶过滤层析结果（A）和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（B）

二、CNNM4蛋白质结构的预测分析

通过AlphaFold 2对其结构进行预测，预测结构结果（图3）表明CNNM4包括4个结构域，分别为胞外结构域、酸性螺旋对结构域、环核苷酸结合同源结构域以及胱硫醚-β-合酶对结构域[22]。其中酸性螺旋对结构域包括3~4个跨膜 α 螺旋，可能促进镁离子在细胞膜上的转运；环核苷酸结合同源结构域与离子通道和cNMP依赖性激酶具有相似的功能；2个胱硫醚-β-合酶基序相互交织，形成Bateman模块，可以同时结合ATP和镁离子，它们触发了重要的构象变化，发挥了调节CNNM4转运活性的重要作用，并且Bateman模块介导了CNNM4与PRLs的相互作用。

图3 CNNM4蛋白结构预测

图4 CNNM4-PRL1/3蛋白复合物模型图

3、讨 论

在肿瘤细胞内含有高浓度的镁离子[23]。现有研究表明，在乳腺肿瘤细胞、头颈部鳞癌细胞、前列腺癌、肺肿瘤及多种肠道肿瘤细胞内，即使在细胞外镁离子浓度低于生理水平时，胞外的镁离子也会向胞内进行转运[24, 25]。一些脑部缺陷如癫痫、偏头痛、抑郁和智力发育障碍等也与镁离子在人体内的水平息息相关[26]。CNNM4在人体组织和器官中的表达水平对肿瘤细胞的发生和发展有着重要影响，而CNNM4常在大脑、骨髓及免疫系统中表达，尤其是在肠道中表达丰富，在人体对镁离子摄取中起着重要的作用[13, 27]。在肿瘤细胞中镁离子能与ATP结合，从而为肿瘤细胞的病理过程提供生物能量[4]。通过使CNNM4过表达从而降低细胞内镁离子水平，限制细胞内的镁离子供应来减缓或者阻止肿瘤细胞的进展，可能将成为肿瘤未来的潜在治疗靶点。

Giménez-Mascarell等人[28]在2019年对CNNM4-PRL1的蛋白复合物模型进行预测后发现，CNNM4在人体内多以对称同源二聚体的形式存在，其中2个胱硫醚-β-合酶基序（CBS1+CBS2）相互交织，形成Bateman模块（图4）。Bateman模块同PRL1产生相互作用形成复合物，导致其互补的CBS1基序发生移位，使得Bateman模块构象发生改变，从而引发PRLs活性受到抑制、CNNM4离子通道关闭，镁离子外排受阻，最终导致镁离子在细胞内的蓄积。同时PRL3与PRL1的蛋白序列同源性超过78%[29]，因此CNNM4-PRL1的蛋白复合物模型对于CNNM4-PRL3复合物模型的进一步预测具有明确的参考意义。最新研究证实，CNNMs蛋白可以选择性结合TRPM7通道，刺激二价阳离子进入细胞[30]。CNNMs与通道蛋白TRPM7的共表达显著增加了细胞对二价阳离子的摄取，有助于其控制细胞内外的镁离子稳态；CNNM4也可以同PRL1/3结合形成复合物并抑制细胞内镁离子的外排，并且现已有研究表明，CNNM4的部分结构已获得揭示，并提出了CNNM4-PRL1复合物可能的模型图[28]。迄今为止，有关CNNM4的整体结构、转运镁离子的分子机制、CNNM4-PRL1/3二元复合物的结构基础以及PRL1/3如何调控抑制CNNM4的功能从而促进肿瘤发生的基本原理仍然存在较大的研究潜力。

综上所述，CNNM4、CNNMs-TRPM7通道及CNNM4-PRL1/3复合物对人体细胞内外镁离子的调节发挥不同的功能，是细胞内外镁离子稳态的关键调节因子。因此，如何通过靶向干预肿瘤组织内镁离子的调控，来阻止或者延缓肿瘤的进展，成为CNNM4相关研究的重要目标。除此以外，CNNM4也参与了其他重要的生理过程，包括可以通过调节精子的钙离子稳态从而对生殖产生影响，和由于基因突变所引起的一类名为贾利里综合征的常染色体隐性家族遗传病的形成，以及部分家族遗传性镁离子缺乏症或者低镁血症的产生等[18-21, 31, 32]。通过对CNNM4蛋白的纯化及初步预测结构进行探讨，可以为之后开发抑制肿瘤发生发展以及转移的临床药物奠定基础。与此同时，对于CNNM4-TRMP7及CNNM4-PRL1/3复合物转运蛋白结构的解析和作用机制的阐明，有利于提前发现和预防肿瘤的发生，同时为防止其发生和发展提供重要的科学理论依据。

基金资助:国家自然科学基金(32200803);中国人民解放军空军军医大学第一附属医院A层次博士科研启动项目(XJARC05);陕西省自然科学基础研究计划重点项目(2021JZ-34);

文章来源:马晨雨,强亦龙,黄天云,等.细胞周期蛋白M4的纯化和初步预测结构探讨[J].中华神经外科疾病研究杂志,2025,19(02):7-11.