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烷基间苯二酚同系物对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤的保护作用

2025-05-24 79 上传者：管理员

摘要：目的探讨5种烷基间苯二酚同系物(C17∶0､C19∶0､C21∶0､C23∶0和C25∶0)对过氧化氢(H2O2)诱导的人结直肠腺癌细胞(Caco-2)氧化损伤的保护作用｡方法以H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤为模型,测定0~80μmol/L烷基间苯二酚预处理后Caco-2细胞的生存率确定最佳处理浓度｡试剂盒法测定不同浓度(5､20和80μmol/L)烷基间苯二酚同系物预处理后Caco-2细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平,细胞培养上清液和细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量､谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)､超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活力｡结果5~80μmol/L烷基间苯二酚同系物对Caco-2细胞无明显毒性作用;600μmol/LH2O2作用4h后,Caco-2细胞平均存活率为55.26%,细胞培养上清液和细胞内的GSH-Px､SOD和CAT活性显著低于对照组(P<0.05),MDA含量显著增加(P<0.05)｡5､20和80μmol/L5种烷基间苯二酚同系物预处理后,细胞ROS水平和MDA含量较造模组有所下降,细胞培养上清液中SOD活性显著升高(P<0.05),80μmol/L组各同系物细胞内GSH-Px和CAT活性均显著升高(P<0.05)｡结论各个烷基间苯二酚同系物均能够通过激活细胞内的抗氧化酶活性､抑制脂质过氧化水平保护H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤｡

关键词：
Caco-2细胞
同系物
氧化应激
氧化损伤
烷基间苯二酚
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氧化应激是由于促氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡,导致大分子损伤和氧化还原信号传导和控制中断[1]｡氧化和自由基反应对细胞造成的破坏与癌症､冠心病､神经退行性疾病等疾病相关,而饮食中的天然抗氧化剂有利于降低这些疾病的风险[2]｡近年来,烷基间苯二酚(alkylresorcinols,ARs)作为饮食中的天然抗氧化剂受到广泛关注｡烷基间苯二酚是一类酚类类脂,特别在小麦､黑麦中大量存在,可作为人体摄入麦类全谷物产品的生物标志物[3]｡烷基间苯二酚具有亲脂性多酚结构,这种分子结构赋予其两亲性,允许其插入磷脂膜,其苯环第5位上主要由奇数个碳烷基侧链取代[4],由于取代的碳烷基侧链上的碳原子个数不同,形成了多种烷基间苯二酚的同系物｡小麦和黑麦中烷基间苯二酚同系物主要有5⁃十七烷基间苯二酚(C17∶0)､5⁃十九烷基间苯二酚(C19∶0)､5⁃二十一烷基间苯二酚(C21∶0)､5⁃二十三烷基间苯二酚(C23∶0)和5⁃二十五烷基间苯二酚(C25∶0)等[5]｡本研究旨在以H2O2诱导的Caco⁃2细胞氧化损伤为体外模型,通过测定5⁃n⁃烷基间苯二酚预处理后抑制活性氧产生的能力和对氧化酶的调节作用,明确单个烷基间苯二酚的细胞抗氧化功能｡

1、材料与方法

1.1试剂与仪器

5种烷基间苯二酚同系物(HPLC≥98%,源叶生物公司),人结直肠腺癌细胞(Caco⁃2,北京北纳生物技术研究院),DMEM(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青公司),CCK⁃8试剂盒(Biosharp公司),0.25%胰蛋白酶､丙二醛(malondialdehyde,MDA)､谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH⁃Px)､超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)､过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒(北京索莱宝公司),Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒､BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天公司),DCFH⁃DA(Sigma⁃Aldrich公司);其余试剂均为分析纯｡酶标仪SpectraMaxi3x,倒置荧光显微镜M7000｡

1.2细胞培养

Caco⁃2细胞采用添加10%血清的DMEM培养液,于37℃､5%CO2的培养箱中培养｡细胞长到80%进行传代,取对数生长期细胞进行后续实验｡

1.3H2O2诱导

Caco⁃2细胞氧化损伤模型的建立取对数生长期的Caco⁃2细胞接种于96孔板中,每孔100μL,细胞密度为2.0×105个/mL｡在37℃､5%CO2条件下培养24h,弃去培养液,加入100μL用DMEM培养基配制的0､100､200､400､600和800μmol/LH2O2溶液,每个浓度设置6个平行孔,在培养箱中孵育1､2､4和24h后,CCK⁃8试剂盒测定吸光度(A),计算细胞存活率(%)｡进一步在600μmol/LH2O2的作用下按照Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒､活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)试剂盒说明进行细胞活死染色和细胞ROS水平的检测,荧光显微镜观察｡

1.4烷基间苯二酚细胞毒性试验

设置0､5､10､20､40和80μmol/L6个烷基间苯二酚同系物剂量组,处理细胞24h后,CCK⁃8试剂盒测定A,计算细胞存活率,筛选出对细胞无毒性的浓度范围进行后续实验｡

1.5细胞抗氧化水平的测定

1.5.1ROS水平测定参照Ren等[6]的DCFH⁃DA荧光探针法略作修改,设置对照组､造模组和干预组,对照组加无血清培养液,造模组为含有H2O2的无血清培养液,干预组为不同浓度(5､20和80μmol/L)各个烷基间苯二酚同系物预处理加H2O2的无血清培养液,细胞在加入烷基间苯二酚预处理后用H2O2孵育4h,去除培养液后向细胞中加入无血清培养基配置的10μmol/LDCFH⁃DA,37℃避光继续培养30min｡用无菌PBS溶液冲洗细胞3次除去细胞外的探针,并立即分别在485nm和530nm的激发波长和发射波长处测量荧光强度｡倒置荧光显微镜采集细胞荧光图像｡

1.5.2MDA水平及抗氧化酶活力的测定

将2.0×105个/mL的Caco⁃2细胞接种于24孔板中｡收集上清液后,用胰酶消化各实验组细胞后,收集细胞悬液;超声破碎细胞,BCA蛋白检测试剂盒测定上清及细胞中总蛋白含量｡相应试剂盒方法测定细胞培养上清及细胞中的SOD､GSH⁃Px､CAT活性和MDA水平｡

1.6统计学分析

所有实验重复3次,结果以x±s表示｡采用SAS9.4软件,多样本间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异具有统计学意义｡

2、结果

2.1建立细胞氧化损伤模型

由表1可见,加入H2O2后2和4h,Caco⁃2细胞的存活率显著下降(P<0.05),但作用24h时细胞的损伤有所恢复,800μmol/LH2O2对细胞的损伤作用最强｡细胞氧化应激损伤模型的最佳条件是使细胞活力保持在50%左右时H2O2的浓度[7],600μmol/LH2O2作用4h时细胞平均存活率为55.26%,结合图1细胞活死染色结果和ROS荧光强度结果,最终选择600μmol/LH2O2作用4h建立细胞氧化损伤模型｡

表1H2O2对Caco⁃2细胞存活率的影响

图1600μmol/LH2O2作用4h对Caco⁃2细胞活性(A)和细胞内活性氧水平(B)的影响

2.2烷基间苯二酚同系物对Caco⁃2细胞存活率的影响

由表2可知,5~80μmol/L烷基间苯二酚同系物对Caco⁃2细胞无明显毒性作用,选取5､20和80μmol/L浓度进行后续干预实验｡

表2烷基间苯二酚同系物处理24h对Caco⁃2细胞存活率的影响

2.3细胞内ROS水平

由表3可见,H2O2处理组Caco⁃2细胞内ROS含量显著高于对照组(P<0.05)｡不同浓度烷基间苯二酚同系物能显著抑制细胞内ROS积累,并且呈现剂量依赖关系,5和20μmol/L组ROS水平有所降低,80μmol/L组显著低于造模组(P<0.05)｡

表3烷基间苯二酚同系物预处理对H2O2培养条件下Caco⁃2细胞内活性氧(ROS)水平的影响

表4烷基间苯二酚同系物预处理对H2O2培养条件下Caco⁃2细胞培养上清液和细胞内氧化还原指标的影响

2.4细胞抗氧化酶活力和MDA水平

由表4可见,与对照组相比,H2O2造模组Caco⁃2细胞培养上清和细胞内的MDA含量显著增加(P<0.05),GSH⁃Px､SOD､CAT氧化酶的活性显著降低(P<0.05)｡烷基间苯二酚同系物预处理后MDA含量有所降低,细胞培养上清中SOD活性显著升高(P<0.05),80μmol/L组各同系物细胞内GSH⁃Px和CAT活性均显著升高(P<0.05)｡

3、讨论

已有许多研究表明烷基间苯二酚复合物具有抗氧化作用[5,8⁃9],然而关于单个烷基间苯二酚同系物的细胞抗氧化研究尚不多见｡Liu等[10]发现20μmol/LC17∶0能有效缓解H2O2造成的ROS升高,但未进行剂量关系的验证,本实验通过不同浓度(5~80μmol/L)烷基间苯二酚预处理,发现在未影响细胞活力的浓度范围内,随着浓度增加其对细胞氧化损伤的保护作用增强｡有研究通过化学放光法测定了黑麦麸皮烷基间苯二酚(C15∶0~C25∶0)和全麦谷物提取物对DPPH自由基的清除能力,表现出烷基侧链的链长对抗氧化活性没有太大的影响｡本研究发现烷基间苯二酚预处理能够一定程度降低H2O2培养条件下细胞内的ROS水平;细胞的SOD､GSH⁃Px酶活性提高而MDA水平有所下降,提示烷基间苯二酚能够激活细胞抗氧化酶类活性､降低细胞脂质过氧化水平｡本实验初步证明了在细胞水平上烷基间苯二酚单个同系物的抗氧化作用,为研究其具体抗氧化能力和作用机制提供了科学依据,在此基础上需进一步开展体内动物实验进行深入探究｡

参考文献:

[4]范湾,王健,白金山,等.膳食烷基间苯二酚在癌症预防中的研究进展[J].中国癌症防治杂志,2023,15(3):349⁃353.

[5]杨新童,李亭,李书国.麦源烷基间苯二酚的提取及其功能特性研究进展[J].粮食与油脂,2022,35(2):6⁃9.

[8]邹燕羽.小麦烷基间苯二酚的制备分析及其对HT22神经细胞氧化损伤的保护作用[D].南京:南京财经大学,2020.

基金资助:国家重点研发计划(No.2022YFF1100505);

文章来源:范志宣,宫照龙,陈晨,等.烷基间苯二酚同系物对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤的保护作用[J].卫生研究,2025,54(03):434-438.