Notch信号属五大基础发育信号,经典Notch信号主要由Notch配体(Jag1,Jag2,Delta-like1、3、4)及Notch受体(Notch1～4)组成[1,2],在细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生理过程中具有重要作用[3,4,5,6]。Notch配体结合膜受体经furin样转化酶(furin-likeconvertase)、金属蛋白酶(metalloprotease,ML)/肿瘤坏死因子-α转换酶(TNF-αconvertingenzyme,TACE)及r-分泌酶(r-secretase)水解后形成可溶性Notch胞内结构域(NICD)转移至细胞核,上调下游Hes家族及Hey家族靶基因的表达激活Notch信号[7,8]。

骨髓间充质干细胞/基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)具有强大的增殖及多向分化的潜能,可形成成纤维细胞克隆集落(CFU-F)或骨、软骨类似聚集体[9],被广泛用于骨组织工程基础及临床研究。骨细胞由间充质干细胞/基质细胞经历成骨细胞分化而来,占骨骼细胞的90%～95%[10],形成能及时响应激素和机械变化的特殊网管结构,动态调控骨微环境影响BMSCs成骨分化[11,12]。近年来大量研究证实,骨细胞亦具有分泌功能,其本身及分泌的生物因子能产生特定微环境直接或间接影响骨髓基质细胞成骨分化及部分骨科疾病的发生发展[13,14,15,16]。

激活骨细胞Notch信号突变鼠表型不一:有研究发现激活骨细胞Notch信号导致骨髓基质细胞成骨分化成熟障碍导致骨量增加[17,18];另有研究发现激活骨细胞Notch信号可抑制祖细胞向成骨分化导致骨量降低[19,20,21,22]。为了明确激活骨细胞Notch对BMSCs成骨分化的影响,本研究在体外利用Ad-Cre激活Notch信号的骨细胞与BMSCs共培养观察其对成骨分化的影响,并探究潜在的机制。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验小鼠

4～6周龄野生C57BL/6小鼠购自重庆医科大学实验动物中心;4～6周龄RosaNotch小鼠购自美国Jackson实验室,由重庆医科大学实验动物中心代养繁殖。RosaNotch老鼠携带靶向构建编码NICD的DNA序列的Rosa26基因座,前部携带可经Cre工具酶作用后缺失导致可溶性Notch胞内结构域(NICD)组成型表达的双侧loxP位点修饰的STOP盒。实验过程中所有动物实验操作符合重庆医科大学动物实验中心伦理及操作要求。

1.1.2主要试剂

完全培养基:10%胎牛血清(FBS,Gibco)+89%α-MEM/DMEM/F12-DMEM/DMEM(HyClone)+1%青霉素-链霉素(PS,HyClone);0.25%胰蛋白酶(HyClone);Ad-Cre、Ad-GFP(重庆德诺和生物科技);BCIP/NBT碱性磷酸酶显色及碱性磷酸酶检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天);TRIzol(Invitrogen);逆转录试剂盒、SyberGreenSupermix(大连宝生物公司),VitC、β-磷酸甘油、地塞米松、茜素红(塞米克)、qPCR引物由上海生工设计并由武汉金斯瑞生物科技有限公司合成,具体引物序列见表1、2。

表1Notch信号靶基因、配体引物序列

表2骨细胞、成骨、成血管标志物引物序列

1.1.3实验仪器

37℃5%CO2细胞培养箱(ThermoFisher),常温高速、低速离心机(平凡仪器),低温高速离心机(Sigma),倒置荧光显微镜(Nikon)。

1.1.4实验细胞

人胚肾293细胞(humanembryonickidney-293,HEK293)购自ATCC公司,野生C57BL/6小鼠BMSCs,RosaNotch小鼠骨细胞于重庆医科大学生命科学研究院细胞培养室培养。

1.2方法

1.2.1基因型鉴定

采集出生后14d左右新生鼠耳部组织于含0.1mg/mL蛋白酶K消化液中56℃消化过夜,提取DNA进行普通PCR扩增后于1.5%琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳分离,并采集图像分析鉴定。

1.2.2骨髓基质细胞及骨细胞的分离培养

取4～6周龄RosaNotch小鼠提取骨细胞[23],即无菌条件下去除双侧股骨、胫骨肌肉组织及干骺端后剪至1～2mm3,1mg/mLⅠ型胶原酶37℃120r/min消化3次,5mmol/LEDTA和1mg/mLⅠ型胶原酶溶液37℃、120r/min交替消化各3次;收集每次处理后消化液并加入等体积含10%FBS的α-MEM完全培养基中和置冰上保存。合并前3次消化所得细胞称f1-3,合并中间3次细胞称f4-6,合并最后3次细胞称f7-9,骨碎片生长出细胞称BC。f1-3、f4-6、f7-9及BC各组细胞以2×105/孔铺板,α-MEM完全培养基37℃5%CO2孵箱中培养5d后进行ALP染色、ALP生化定量检测,qPCR检测成骨细胞标志物ALP及骨细胞标志物DMP1、SostmRNA转录水平。1mL无菌注射器冲出4～6周龄野生C57BL/6小鼠骨髓腔内细胞[24],800r/min离心5min重悬后加入F12/DMEM完全培养基,置37℃5%CO2孵箱中培养。骨碎片中生长出的细胞经形态学观察及特异性标志物[25]检测后鉴定为骨细胞(图1)。

1.2.3腺病毒扩增及感染滴度测定

实验过程中所用到的病毒均由HEK293细胞(DMEM完全培养基中培养)利用Ad-Easy系统扩增,并利用按照绿色荧光蛋白标记法进行滴度测定[26],滴度测定结果分别为:Ad-GFP:2.07×1011GFU/mL,Ad-Cre:1.83×1011GFU/mL。骨细胞按照2×104/孔铺板(24孔板)贴壁后,分别加入稀释10倍后的Ad-GFP及Ad-Cre2、4、8、16、32、64μL进行感染(n=3),倒置荧光显微镜下观察最佳感染滴度,最终本实验中Ad-GFP及Ad-Cre病毒原液的使用量均为1.6μL/2×104。

1.2.4骨细胞与BMSCs共培养

骨细胞以2×104/孔铺板,贴壁后加入相应腺病毒作用24h后,无菌PBS缓冲液清洗后分别向Blank组、Ad-GFP组及Ad-Cre组中加入8×104/孔野生C57BL/6小鼠BMSCs共培养,共培养5d后进行ALP染色,提取ALP生化定量样本及RNA样本进行后续操作(n=3)。

1.2.5ALP染色

细胞培养5d后按照BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒说明书进行ALP染色,去离子水清洗后显微镜下观察并采集图像(n=3)。

1.2.6ALP活性测定

BCA蛋白浓度测定:培养5d后每孔加入300μL50mmol/LpH=7.4Tris-HCl,超声破碎仪破碎细胞后离心收集上清,按BCA蛋白浓度测定试剂盒操作检测λ=592nm处光密度值,并根据标准曲线计算样品蛋白量。ALP含量及活性测定:根据碱性磷酸酶测定试剂盒操作测定λ=405nm处光密度并记录作用时间,根据标准底物浓度曲线计算ALP物质的量;根据蛋白量与ALP物质的量及作用时间计算ALP相对活性(n=3)。

1.2.7细胞总RNA提取、逆转录及qPCR

共培养5d后,Trizol提取总RNA,按照TaKaRa逆转录试剂盒操作说明于冰上依次加入相应试剂制备cDNA,产物5倍稀释后采用qPCR技术测定相应目的基因mRNA的转录水平。所有基因转录水平均以GAPDH基因表达量作为对照(n=3)。引物序列见表1、2。

1.2.8茜素红染色(钙盐沉积实验)

共培养3d后将α-MEM完全培养基更换为含50mg/LVitC、0.1μmol/L地塞米松及10mmol/Lβ-磷酸甘油的成骨诱导培养基,37℃、5%CO2条件下培养21d后按照茜素红染色试剂盒说明书进行染色,去离子水清洗后普通光学显微镜下观察并采集图像(n=3)。

1.2.9统计学分析

使用SPSS17.0对实验数据进行分析,结果以x¯±s表示;采用单因素方差分析比较多组间差异,studentt检验比较两组间差异。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1RosaNotch小鼠基因型及骨细胞鉴定

提取RosaNotch小鼠DNA扩增后分别对WT和Mut序列进行PCR扩增及鉴定,仅表达Mut序列(flox序列)不表达WT基因者为RosaNotch小鼠(f/f),仅表达WT基因不表达Mut序列者为野生型小鼠(+/+)(图1A)。

f1-3、f4-6、f7-9及BC各组细胞以2×105/孔铺板,5d后进行ALP染色、ALP生化定量及qPCR检测。ALP染色结果显示BC组展示最弱ALP染色强度(图1B);普通光学显微镜下观察骨细胞突触多、体积小,成骨细胞突触少、体积大(图1C);ALP生化定量显示f7-9ALP活性相较f1-3、f4-6显著降低(P<0.05),BC组ALP活性较f7-9显著降低(P<0.05,图1D);qPCR结果显示成骨分化标志物ALPmRNA转录水平在各组中的表达相继降低(P<0.05),该结果与ALP染色及ALP生化定量结果相符;骨细胞特异性标志物DMP1、Sost在BC中高度表达(P<0.05),而在f1-3、f4-6中未检测到(图1E)。以上结果提示BC组生长出的细胞绝大部分为骨细胞,可用于后续实验。

2.2Ad-Cre激活RosaNotch骨细胞Notch信号

RosaNotch小鼠骨细胞以2×105/孔铺板至24孔板,贴壁后分别加入Ad-GFP及Ad-Cre腺病毒,24h后于倒置荧光显微镜下观察骨细胞中绿色荧光蛋白表达情况,光镜下显示细胞状态良好,转染效率高于50%(图2A)。5d后提取mRNA检测Notch信号特异性靶基因表达。qPCR结果显示Ad-Cre组Notch信号特异性靶基因Hes1、Hey1、HeyL相较Ad-GFP组显著增高(P<0.05,图2B),提示骨细胞Notch信号成功激活。

2.3激活骨细胞Notch信号抑制BMSCs成骨分化标志物表达及钙盐沉积水平

根据实验设计检测共培养5d后进行ALP染色、ALP生化定量、成骨分化标志物及钙盐沉积水平检测。ALP染色结果显示Blank组与Ad-GFP组无显著差异,Ad-Cre组相较Blank组及Ad-GFP组显著降低(图3A);该结果与ALP生化定量及ALPmRNA转录水平(图3B、C)相符。qPCR结果显示Ad-Cre组共培养物成骨标志物Runx2及OsterixmRNA转录水平相较Ad-GFP组及Blank组显著降低(P<0.05)。茜素红染色结果显示成骨诱导培养基共培养21d后Ad-Cre组钙盐沉积水平显著低于Blank组及Ad-GFP组,Blank组与Ad-GFP组间未见统计学差异(图3C、D)。因此,激活骨细胞Notch信号可抑制BMSCs成骨分化及钙盐沉积水平。

图1小鼠基因型鉴定

图2Ad-Cre激活RosaNotch小鼠骨细胞Notch信号

图3激活骨细胞中Notch信号对BMSCs成骨分化标志物转录水平及钙盐沉积的影响

2.4激活骨细胞中Notch信号对Notch配体表达的影响

进一步检测激活Notch信号骨细胞与BMSCs共培养后Notch配体表达情况,qPCR结果显示Jag1mRNA转录水平较Blank组及Ad-GFP组显著升高(P<0.05,图4A),Jag2、Dll1mRNA转录水平较Ad-GFP及Blank组无统计学差异(图4B、C);Ad-GFP组及Ad-Cre组中Dll3的表达较Blank组均显著增高(P<0.05,图4D);Dll4mRNA转录水平较Blank组及Ad-GFP组显著降低(P<0.05,图4E)。

2.5激活骨细胞Notch信号对成血管因子表达的影响

Notch配体与血管生成紧密相关,本研究进一步检测成血管相关标志物VEGF、CD31、HIF1α、EMCNmRNA转录水平。qPCR结果显示激活骨细胞Notch信号后共培养物VEGF、CD31、HIF1α、EMCNmRNA转录水平较Blank组及Ad-GFP组显著增高(P<0.05),而Blank组与Ad-GFP组间无显著差异(图5)。

3、讨论

Notch信号是高度保守的信号传导通路,研究显示激活同一细胞谱系不同分化状态细胞可造成不同影响[21,27,28]:激活2.3kbⅠ型胶原启动子通过直接结合Runx2抑制反式激活功能抑制早期成骨细胞的分化发育,刺激早期成骨细胞增殖[27],导致成骨细胞成熟障碍和功能异常的编织骨沉积,造成骨量增加和生长迟缓;激活3.6kbⅠ型胶原启动子控制的NICD通过抑制干细胞/祖细胞的成骨分化导致成骨细胞数量减少、骨量减少[21]。

CANALIS等[19]利用DMP1-10kb-Cre激活骨细胞经典Notch信号可导致骨质疏松症,但该研究过程中同时激活突变鼠骨细胞及成骨细胞中Notch信号,因此该结果不能证实仅激活骨细胞Notch信号对BMSCs成骨分化的影响。本研究利用Ad-Cre体外激活骨细胞Notch信号后与野生C57BL/6小鼠BMSCs共培养观察对BMSCs成骨分化的影响,结果显示野生C57BL/6BMSCs与激活Notch信号骨细胞共培养ALP染色及21d细胞外基质矿化水平相较Ad-GFP组及Blank组显著降低;qPCR结果显示成骨分化标志物(ALP、Osterix、Runx2)表达相较Ad-GFP组及Blank组显著降低(P<0.05),因此激活骨细胞Notch信号可抑制BMSCs早期成骨分化及晚期细胞外基质矿化水平。过去大量Notch信号过表达小鼠模型研究产生争议的原因可能系同时激活多阶段成骨细胞系细胞Notch信号,祖细胞、骨细胞Notch信号活性低,未产生显著抑制表型,而骨髓基质细胞或成骨细胞中Notch活性较强,可观察到骨量发生显著增加[29]。TU等[30]的研究发现激活骨细胞Wnt信号小鼠骨量显著增高,Notch信号受体及配体亦处于过表达状态,在此基础上利用DAPT抑制Notch信号可抑制由激活骨细胞Wnt信号促进的成骨分化[31];WANG等[32]的研究发现激活Notch信号导致Runx2和早期成骨分化因子下调但不影响p-Smad1/5/8的表达,DAPT阻断Notch信号后通过过表达p-Smad1/5/8影响成骨分化,故激活骨细胞Wnt信号及成骨细胞Notch信号的强大成骨作用将激活骨细胞内Notch信号的抑制成骨作用抵消,最终表现为高骨量表型。Notch信号在血管内皮发育过程中亦发挥重要作用[33],研究显示Dll4负调节血管内皮生长因子介导的血管发芽和分支[34];且Notch配体Dll4与Jag1在调节血管生成中的作用相反[35]。基于以上研究基础,本研究进一步检测血管生成标志物及Notch配体的表达情况,qPCR结果显示成血管标志物VEGF、HIF1α、CD31、EMCN及Notch配体Jag1mRNA转录水平显著增高(P<0.05),Dll4mRNA转录水平显著降低(P<0.05)。因此,研究结果提示激活骨细胞Notch信号可能通过增高Jag1、降低Dll4促进BMSCs成血管因子及内皮细胞因子表达从而降低成骨分化。

图4激活Notch信号骨细胞与BMSCs共培养物Notch配体表达情况(n=3)

图5激活Notch信号骨细胞与野生型小鼠BMSCs共培养物成血管因子表达情况(n=3)

激活不同分化阶段成骨谱系细胞Notch信号可对成骨分化产生不同影响,本研究证实体外激活骨细胞Notch信号抑制BMSCs成骨分化。接下来本研究将进一步明确具体作用机制,同时利用DMP1-8kb-Cre工具鼠与RosaNotch小鼠构建激活骨细胞Notch信号的转基因小鼠,进行动、静态骨组织变化检测及转录组测序,进一步明确具体作用分子及作用机制。

谢映春,涂小林.体外激活骨细胞Notch信号对骨髓基质细胞成骨分化的影响[J].第三军医大学学报,2020,42(09):891-898.