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文题释义：

单层细胞诱导内皮细胞分化法：在基质包被的培养板上单层培养干细胞，并且在不同的时间点将不同的化学分子或细胞因子添加到培养液中对细胞进行处理，促使细胞向中胚层分化后再进一步分化为内皮谱系。

内皮细胞：是指排列在血管或淋巴管内表面的单层细胞，其中血管内表面的内皮细胞称为血管内皮细胞。人体血管内皮细胞功能障碍或丧失功能，通常会引起动脉粥样硬化，与心血管疾病的风险成正相关。

内皮细胞是指排列在血管或淋巴管内表面的单层细胞，其中血管内表面的内皮细胞称为血管内皮细胞。人体血管内皮细胞功能障碍或丧失功能，通常会引起动脉粥样硬化，与心血管疾病的风险成正相关[1]。诱导多能性干细胞是一种新型的多能性干细胞，它具有和胚胎干细胞类似的特征，能够快速增殖的同时具有分化为多种细胞类型的能力[2,3,4,5]。更重要的是，在干细胞移植治疗方面，使用自体来源的诱导多能性干细胞进行移植治疗，既可避免异体移植引起的免疫排斥反应，又可回避使用人胚胎干细胞的伦理问题。

目前，人和小鼠的血管内皮细胞培养及诱导分化体系已经比较成熟。干细胞定向分化为内皮细胞的方法主要有基质细胞共培养法、拟胚体分化法以及单层细胞分化法等3种方法。2009年，TAURA等[6]采用基质细胞共培养法(与小鼠骨髓间充质细胞OP9共培养)，将人诱导多能性干细胞诱导分化为内皮细胞。基质细胞共培养法效率极低，而且获得的细胞不纯[7]。2008年，NG等[8]采用拟胚体分化法，将胚胎干细胞诱导为拟胚体，然后添加血管内皮生长因子诱导其分化为内皮细胞。拟胚体分化法实验周期较长，诱导效率低，通常只有10%左右[8,9]。2013年，LIPPMANN等[10]采用单层细胞分化法，在Matrigel包被的培养板上使用不含碱性成纤维生长因子的培养基诱导细胞分化，几天后更换为内皮细胞培养液继续培养，最终通过流式分选获得了较高纯度的内皮细胞。最近的研究表明，通过改良的单层细胞分化法诱导人胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞，在不借助流式分选的情况下效率也能接近90%[11]。综上所述，单层细胞分化法更适合用于干细胞向内皮细胞的定向分化。

猪作为一种重要的农用家畜，其器官大小及生理学特征与人体具有很大的相似性，猪的寿命又相对较长，因而被认为是研究人类心血管及代谢性疾病的良好动物模型[12]。对其多能性细胞的培养及定向血管内皮细胞分化体系的研究将为创建心血管疾病模型猪提供保障。目前，很多研究组通过不同的方法建立了猪诱导多能性干细胞(porcineiPSCs,piPSCs)[13,14,15,16,17]，但是关于其向血管内皮细胞定向分化的研究目前仅有1篇文章——2013年，GU等[18]报道了将猪诱导多能性干细胞诱导分化为内皮细胞的方法，但其采用了周期较长且效率较低的拟胚体诱导分化途径，培养液成分也相对复杂，推广应用的潜力不大。此外，有些研究组采用猪间充质细胞进行内皮细胞的诱导分化[19,20,21]，尽管间充质细胞具有多向分化潜能，但是做为成体干细胞，其传代能力有限。

该研究使用多种细胞因子和化学小分子对猪诱导多能性干细胞进行诱导分化，成功获得了表达血小板内皮细胞黏附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule1,PECAM-1，也叫CD31)的血管内皮细胞，其具有与猪永生化主动脉血管内皮细胞相似的形态、基因表达模式及功能特征。此外，使用相同的诱导方法对人胚胎干细胞进行了诱导分化，结果发现在该体系下人胚胎干细胞的分化效率远低于猪诱导多能性干细胞的分化效率，这可能与诱导过程中二者谱系基因表达模式上的差异相关，也印证了猪和人在细胞分化及发育上的物种差异。该研究建立了一种适合猪诱导多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的方法，为评价大动物血管内皮细胞自体移植效果及创建心血管疾病模型猪提供了可能。

1、材料和方法

1.1设计

体外干细胞定向诱导分化为内皮细胞实验。

1.2时间及地点

2017年10月至2018年12月在东北农业大学生命科学学院Lab217胚胎工程实验室完成。

1.3材料

1.3.1细胞

猪诱导多能性干细胞为作者所在实验室现存的细胞[16]；猪永生化主动脉血管内皮细胞(AOCs)购买于爱必梦生物技术有限公司(Abmgood，货号T0448)；人胚胎干细胞(H1)及人静脉血管内皮细胞(HUVEC)由苏州大学心血管病研究所胡士军教授提供；小鼠胎儿成纤维细胞由哈尔滨医科大学雷蕾教授提供。

1.3.2细胞培养液

MX培养液由38%KO-DMEM、24%DMEM/F12、24%Neurobasal、10%KOSR、0.145g/LL-谷氨酰胺、3.9mg/Lβ-巯基乙醇、0.5%非必须氨基酸、0.25%N2、0.5%B27、0.25g/L牛血清白蛋白、5μg/L人源白血病抑制因子、8μg/L碱性成纤维生长因子和1%青霉素-链霉素(ThermoFisher，货号10378016)配制而成。PSCeasy®人多潜能干细胞培养基(Cellapy，货号CA1001500);EGM-2培养液(Lonza，货号CC-3162);1640基础培养基(ThermoFisher，货号670089)。

1.3.3抗体

CD31(Abcam，货号ab28364);CD144(SantaCruzBiotechnology，货号sc-9989);vWF(Abcam，货号ab6994);eNOS(Abcam，货号ab5589);PorcineCD31AlexaFluor®488(R&DSystems，货号FAB33871G);HumanCD31/PECAM-1AlexaFluor®488(R&DSystems，货号FAB806G)。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养

猪诱导多能性干细胞使用MX培养液培养在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，传代时使用1g/L胶原酶Ⅳ消化，1∶5接种。人胚胎干细胞使用PSCeasy®人多潜能干细胞培养基培养在1∶200稀释后的Matrigel(Corning，货号356231)上，传代时使用0.5μmol/LEDTA消化，1∶6接种。人静脉血管内皮细胞和猪永生化主动脉血管内皮细胞使用EGM-2培养液培养，传代时使用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3接种。

1.4.2血管内皮细胞的定向诱导

20代之后的猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞接种于稀释Matrigel包被的12孔板中，1.2×104/孔，当细胞融合度达到90%时，更换为分化培养基：猪诱导多能性干细胞的基础分化培养基为MX培养液去掉碱性成纤维生长因子和人源白血病抑制因子；人胚胎干细胞的基础分化培养基为1640基础培养基添加2%L-抗坏血酸和0.5%牛血清白蛋白。

猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞向血管内皮细胞的诱导程序：第1,2天，向基础分化培养基中添加6μmol/LCHIR99021(STEMGENT，货号04-0004,GSK-3抑制剂)；第3,4天，向分化培养基中添加50μg/L碱性成纤维生长因子和25μg/L骨形态发生蛋白4；第5-7天，向分化培养基中添加50μg/L血管内皮生长因子和25μg/L骨形态发生蛋白4。诱导过程中每天更换培养液。第7天，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代至0.1%明胶包被的细胞培养板上，用EGM-2培养液继续培养3d；第10天，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞并用流式细胞仪分选CD31阳性细胞，分选后的细胞用EGM-2培养液继续培养。

1.4.3RNA提取和荧光定量PCR

收集诱导过程中0-4d以及第10天的猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞，细胞总RNA通过PureLinkRNAmini试剂盒(QIAGEN，货号74104)提取，使用HighCapacitycDNAReverseTranscriptionKit试剂盒(ABI，货号4368814)将RNA反转录为cDNA,cDNA保存于-20℃，作为定量PCR中的模板备用。

利用SYBRExTaqPCR试剂盒(TaKaRa，货号RR420A)实时荧光定量PCR，根据说明书设定反应体系与反应条件，引物退火温度为60℃。每项检测进行3次重复。根据2-ΔΔCt计算基因相对表达量，即实验组相对于对照组的基因表达量统计结果。实验组为诱导后的猪诱导多能性干细胞以及人胚胎干细胞，对照组为未经处理的猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞。基因引物的序列见表1,2。

表1RT-PCR引物信息(猪)

表2RT-PCR引物信息(人)

1.4.4免疫荧光染色

经过流式分选后的分化细胞在状态稳定后使用40g/L多聚甲醛室温固定30min,PBS清洗3次，1%TritonX-100在37℃透膜1h,PBS清洗3次，封闭液(体积分数为10%绵羊血清和0.05%牛血清白蛋白，PBS母液)在37℃封闭1h，加入封闭液稀释的CD31、CD144、eNOS、vWF一抗(1∶200)在4℃孵育过夜，将细胞置于水平摇床上用清洗液(每1mLPBS中加入1µL10%TritonX-100和1µLTween-20)清洗3次，每次5min，加入清洗液稀释的二抗在37℃孵育1h，清洗液清洗3次，加入10mg/L的Hoechst33342(Sigma，货号B2261)在避光条件下染核5min，最后加入防荧光猝灭剂封固，在Nikon80i显微镜下观察。

1.4.5流式分析

在定向诱导的第10天，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞并重悬于DPBS(ThermoFisher，货号1419250)中。细胞计数后，根据厂商提供的操作流程，将抗体PorcineCD31/PECAM-1AlexaFluor®488-conjugatedAntibody和猪诱导多能性干细胞在室温孵育30min;HumanCD31/PECAM-1AlexaFluor®488-conjugatedAntibody和人胚胎干细胞在室温孵育30min，然后用DPBS清洗细胞后室温300×g离心5min，重复3次，清洗后在FACSCalibur(BDBiosciences)上通过流式细胞术分选荧光标记的细胞，并用Flowjo软件分析。每项检测进行3次重复。

1.4.6毛细血管网络形成检测

猪永生化主动脉血管内皮细胞、人静脉血管内皮细胞、猪诱导多能性干细胞诱导分化获得的内皮细胞和人胚胎干细胞诱导分化获得的内皮细胞在体外进行微血管网状结构形成实验。使用60μL/孔的Matrigel包被96孔板，37℃孵育30min，每孔接种1.3×103细胞，培养6h后在Nikon80i显微镜下观察。

1.4.7低密度脂蛋白摄取检测

猪永生化主动脉血管内皮细胞、人静脉血管内皮细胞、猪诱导多能性干细胞诱导分化获得的内皮细胞和人胚胎干细胞诱导分化获得的内皮细胞使用DiI标记的人源乙酰化低密度脂蛋白试剂盒(YEASEN,20606ES76)检测其低密度脂蛋白的吸收能力。细胞培养液中添加终质量浓度为25mg/L的HumanDil-Ac-LDL，于37℃培养4h后更换培养液，Nikon80i显微镜下检测细胞是否呈现红色荧光，以此证明细胞是否具有吸收低密度脂蛋白的能力。

1.5主要观察指标

(1)干细胞在分化第1阶段的胚层标记基因表达；(2)干细胞在分化第3阶段的内皮标记基因表达；(3)干细胞在流式分选后的CD31阳性细胞百分比；(4)分选后的猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞的鉴定。

1.6统计学分析

使用的软件为SPSS21.0版本，数据以表示，不同组别之间的差异分析采用ANOVA方法，P<0.05为差异有显著性意义。利用GraphPadPrism8.0软件绘图。

2、结果

2.1干细胞向血管内皮细胞定向诱导分化第1阶段胚层谱系特异性基因的表达分析

采用单层细胞培养法将猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞向内皮细胞定向诱导分化，分化分为3个阶段，第1阶段(第1-4天)，干细胞向中胚层诱导分化；第2阶段(第5-7天)，中胚层向血管内皮诱导分化；第3阶段(第8-10天)，内皮细胞状态的稳定。

在诱导分化的第1阶段，采用RT-PCR方法检测猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞诱导后的胚层谱系特异性基因表达。结果发现，对于原条期标记基因Brachyury和MIXL1，猪诱导多能性干细胞在诱导第一二天上调，在第三四天迅速下降，见图1A，人胚胎干细胞与猪诱导多能性干细胞类似，但基因表达水平变化幅度更大，见图1B(纵坐标分别为百级和千级)；对于中胚层标记基因KDR、PDGFRa和PDGFRb，猪诱导多能性干细胞在诱导第1-4天持续上调，见图1A，而人胚胎干细胞中KDR基因在诱导第2天出现表达高峰后下降到初始水平，PDGFRa和PDGFRb持续上调，与猪诱导多能性干细胞表现一致，见图1B；对于内胚层标记基因AFP，猪诱导多能性干细胞在诱导第一二天上调，在第三四天迅速下降，见图1A，而人胚胎干细胞在诱导第一二天表达量基本不变，在第三四天迅速下降，见图1B。

2.2干细胞向血管内皮细胞定向诱导分化第2阶段血管内皮细胞标记基因的表达分析

猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞经过第1阶段的诱导走向了中胚层命运，然后进行第2阶段的诱导分化(第5-7天)，随后将细胞传代至0.1%明胶包被的培养板上并用EGM-2培养液继续培养3d(第8-10天)，稳定内皮细胞状态。采用RT-PCR法检测诱导后的血管内皮细胞标记基因的表达，初始细胞作为阴性对照，猪永生化主动脉血管内皮细胞和人静脉血管内皮细胞作为阳性对照。结果显示，相较于初始状态，猪诱导多能性干细胞在完成3个阶段的诱导后，内皮细胞标记基因CD31、CD144、KDR、vWF和CD105特异性高表达，其中KDR和vWF甚至达到了阳性对照猪永生化主动脉血管内皮细胞中的表达水平，见图2A；相似的，相较于初始状态，人胚胎干细胞在完成3个阶段的诱导后，内皮细胞标记基因CD31、CD34、CD144和vWF特异性高表达，但相较于阳性对照人静脉血管内皮细胞，其表达水平还存在一定的差距，见图2B。这些结果表明，经过第1阶段的干细胞向中胚层诱导、第2阶段的中胚层向血管内皮的定向诱导以及第3阶段的内皮细胞培养，完成了将干细胞向血管内皮细胞的诱导过程，猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞的内皮细胞标记基因的表达水平趋近于阳性对照细胞。另外，从标记基因表达情况分析，在诱导的第2和第3阶段，猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞可能在响应该诱导体系上无明显差异。

2.3猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞向血管内皮细胞定向分化的效率

完成第3阶段诱导后，对获得的细胞进行流式分选，将获得的CD31阳性细胞分别命名为猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞，并统计其百分率。结果显示，猪诱导多能性干细胞诱导分化后的CD31阳性细胞比率为(20.54±3.73)%，见图3A，而人胚胎干细胞诱导分化后的CD31阳性细胞比率仅为(6.26±1.35)%，见图3B。该结果表明，猪诱导多能性干细胞可以高效地诱导分化为血管内皮细胞，而人胚胎干细胞定向分化为血管内皮细胞的效率较低。

2.4猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞的鉴定

对分选获得的CD31阳性猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞进行了形态、基因表达及体外功能鉴定。猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞形态与猪永生化主动脉血管内皮细胞类似，呈现出扁平上皮的形态；而人胚胎干细胞来源内皮细胞形态与人静脉血管内皮细胞存在差别，人胚胎干细胞来源内皮细胞体积更小，核质比更大。血管内皮标记基因的免疫荧光检测显示，猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞均表达内皮细胞标记基因CD31、CD144、vWF和eNOS，见图4，其表达模式与猪永生化主动脉血管内皮细胞和人静脉血管内皮细胞类似，见图4。

体外成血管实验结果表明，接种到Matrigel上6h后，猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞均可形成网状微血管样结构，其分布与阳性对照猪永生化主动脉血管内皮细胞和人静脉血管内皮细胞相似，见图5A-D。另外，低密度脂蛋白摄取能力实验结果表明，猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞在显微镜下呈现红色荧光，说明其具有摄取低密度脂蛋白的能力，见图5E-L。

综上所述，猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞经过定向诱导分化得到的细胞不仅具有内皮细胞的形态学特点、基因表达模式，还具有内皮细胞的功能特征。

3、讨论

许多心血管疾病的主要成因是血管内皮细胞发生了不可修复的损伤，极大地影响了人类健康[22,23,24]，细胞移植被认为是最有前景的治疗方法。在猪这种器官大小和生理特征与人类似的模式动物上开展相关研究，对于最终利用细胞移植治疗心血管疾病具有重大意义。此外，通过患者来源的诱导多能性干细胞定向诱导分化获得的血管内皮细胞，不仅可以提供充足的细胞来源用于移植治疗，还可以消除体内来源细胞由于在体外传代次数较高而导致的预后不良。

该研究采用了一种能够将猪诱导多能性干细胞分化为血管内皮细胞的方法，这种方法使用了单层细胞直接诱导的策略，过程简单、清晰、有效。虽然GU等[18]在2013年第1次报道用猪诱导多能性干细胞诱导分化产生了血管内皮细胞，但他们采用的是先悬浮培养获得拟胚体再继续贴壁诱导的方法，该诱导方法周期长。另外，虽然文章中没有对其诱导效率进行说明，但是对比人胚胎干细胞的研究发现，单层细胞诱导产生内皮细胞的效率远高于拟胚体的诱导方法[25,26,27,28]，同时有研究表明使用拟胚体的诱导方法在不同的细胞系中不能被重复[10,28,29]。

图1在诱导分化前期猪诱导多能性干细胞(A)和人胚胎干细胞(B)的谱系特异性基因的表达

图2猪诱导多能性干细胞(A)和人胚胎干细胞(B)定向诱导后内皮细胞标记基因的表达

图注：图中a,b,c代表不同组之间差异有显著性意义(P<0.05)

图3流式细胞术检测猪诱导多能性干细胞(A)和人胚胎干细胞(B)定向诱导分化后的CD31阳性细胞比率(图中展示的是代表性结果)

图4免疫荧光检测血管内皮细胞标记基因的表达(标尺为50μm)

图注：猪永生化主动脉血管内皮细胞(A-D)作为猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞(E-H)的阳性对照；人静脉血管内皮细胞(I-L)作为人胚胎干细胞来源内皮细胞(M-P)的阳性对照

图5猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞和人胚胎干细胞来源内皮细胞的功能学检测(标尺为50μm)

图注：猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞(B)和人胚胎干细胞来源内皮细胞(D)的体外成管实验，其中猪永生化主动脉血管内皮细胞(A)和人静脉血管内皮细胞(C)作为阳性对照；猪诱导多能性干细胞来源内皮细胞(G,H)和人胚胎干细胞来源内皮细胞(K,L)的低密度脂蛋白吸收实验，其中猪永生化主动脉血管内皮细胞(E,F)和人静脉血管内皮细胞(I,J)作为阳性对照细胞

CHIR99021是一种GSK3β信号通路抑制剂，在小鼠胚胎干细胞培养中与MEK/ERK信号通路抑制剂PD325901具有协同作用，能够维持并提高干细胞的多能性[30,31]。以往研究表明，短期的CHIR99021处理能够启动人胚胎干细胞向原条时期分化[32]。作者进行的研究验证了这一结果，在诱导分化的第1,2天，培养液中添加CHIR99021促进了猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞中原条期标记基因Brachyury和MIXL1表达量的提高，表明干细胞开始向原条时期分化。胚胎发育过程中，原条会继续向中胚层和内胚层分化，而内皮细胞则来源于中胚层。据此，作者又检测了中胚层和内胚层标记基因的表达变化，结果发现诱导分化前期猪诱导多能性干细胞的中胚层标记基因KDR、PDGFRa和PDGFRb的表达量同时上调，表明猪诱导多能性干细胞在原条标记基因激活后开始向中胚层分化。KDR是一种受体酪氨酸激酶，也叫血管内皮生长因子受体2，是侧板中胚层的标记基因，其特异性表达是侧板中胚层分化为内皮的基础。在很多研究中KDR作为内皮祖细胞或内皮细胞的标记基因用于监测细胞是否向侧板中胚层分化[28,33]。研究表明，人胚胎干细胞向内皮细胞分化过程中，添加血管内皮生长因子后KDR的表达量明显上调，而在添加血管内皮生长因子之前KDR的表达量几乎不变[29]。值得注意的是，作者发现在第1阶段的诱导过程中，人胚胎干细胞在诱导第2天出现KDR表达高峰后下降到初始水平，这与前人的研究结果类似，说明该实验采用的诱导体系适合猪诱导多能性干细胞，但不太适合人胚胎干细胞，也从侧面反映出不同物种间细胞分化机制上存在显著差异，也可能是造成人胚胎干细胞产生CD31阳性细胞比率较低的原因。PDGFRa和PDGFRb是中间中胚层的标记物[34,35,36]，在人胚胎干细胞诱导分化前期，PDGFRa和PDGFRb的表达量上调，说明人胚胎干细胞开启了中胚层分化，但是在未添加血管内皮生长因子时没有进一步向侧板中胚层分化[28,33]。AFP是内胚层的标记基因之一[37,38]，猪诱导多能性干细胞在诱导分化前期AFP表达有短暂上调，而在碱性成纤维生长因子处理后其表达量降低，该结果可能是由于碱性成纤维生长因子诱导原条向中胚层分化引起的[39,40,41]。

在人和小鼠的多能性干细胞向内皮细胞分化的研究中，很多研究组把目标集中在诱导体系的优化上[42,43]，目前有的研究组不通过流式分选就能够获得90%以上的CD31阳性细胞比率[11]。但是在大动物中对内皮细胞分化的研究却很少，仅有的研究也没有对内皮细胞的诱导分化效率进行检测，尽管有很多研究组通过不同的方法建立了猪的诱导多能性干细胞系，但是很少有关于从猪诱导多能性干细胞中获得内皮细胞的研究报道。通过流式细胞分选诱导分化第10天的细胞，发现猪诱导多能性干细胞中CD31的阳性细胞比率高于人胚胎干细胞中CD31阳性细胞比率，说明这种诱导方法更适合于猪诱导多能性干细胞向内皮细胞的分化。

该研究采用了一种在体外将猪诱导多能性干细胞诱导分化为血管内皮细胞的无血清单层诱导方法，获得的细胞表达内皮细胞标记基因CD31、CD144、vWF和eNOS，同时还具有内皮细胞的功能特性。与此同时，通过对比人胚胎干细胞和猪诱导多能性干细胞在诱导分化过程中谱系基因的表达模式以及2种细胞的诱导分化效率，发现这种诱导方法更适合猪多能性干细胞向血管内皮细胞的分化。当然，这种方法的诱导分化效率和人与小鼠的诱导效率相比很低，因为关于猪诱导多能性干细胞向血管内皮细胞分化的潜在机制尚未清楚，同时可能与猪和人、小鼠之间存在物种特异性有关。在未来的研究中，需要将重点放在如何进一步提高猪诱导多能性干细胞向内皮细胞分化的效率上，在此基础之上对猪诱导多能性干细胞向内皮细胞分化过程中的潜在机制进行研究。

伟人悦,厉雪纯,李妍,于扬,张宇,刘忠华.无血清单层细胞诱导法培养猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞[J].中国组织工程研究,2020,24(31):4971-4978.

基金:黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才(UNPYSCT-2016010),项目负责人:张宇.