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文题释义：

近日节律基因：是对维持生物体昼夜节律起关键性作用的节律基因，受生物钟控制，且表达量随昼夜循环而发生节律性变化，通过振荡器系统形成反馈调节环路而调控生物节律。近日节律基因控制着一系列生理活动，包括觉醒周期、内分泌、心血管活动、体温、胃肠道蠕动以及能量代谢等。

Rev-erbα：由甲状腺受体α(TRα)的反义链编码，是重要的近日节律基因，将昼夜节律与新陈代谢通路的转录调控联系起来。Rev-erbα是一种强大的转录抑制因子，在哺乳动物的核心分子节律中发挥重要作用，同时也是肝脏和棕色脂肪组织等代谢组织中钟基因输出的关键调节因子。

骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞和软骨细胞[1,2]。骨髓间充质干细胞在正常骨代谢中发挥着关键作用，其成骨能力下降所导致的骨质疏松症已成为影响世界范围内人口生活质量的全球性健康问题。哺乳动物的骨形成是一个复杂而精细的过程，需要协调成骨细胞和破骨细胞的活性以维持骨稳态[3,4]。成骨细胞功能障碍是骨质疏松症发病机制的重要因素，但其机制尚不清楚[5,6]。骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞是由多个转录因子严格控制的。尽管已经报道过许多因子，包括转录因子、细胞因子和miRNA通过调节成骨细胞和破骨细胞活性来促进骨形成，但是在分子水平上严格控制骨平衡的机制仍然是未知的[7]。

核受体(NRs)是一类配体依赖和独立的转录因子，参与激素(雌激素、甲状腺)、维生素(D和A)、代谢物(膳食脂类、胆汁酸、外源性药物、药物)和其他细胞内信号的转录过程[8,9]。核受体与相应的配体相互作用，调控众多靶基因的表达，在机体的生长发育、新陈代谢、细胞分化及体内许多生理过程中发挥重要作用。维生素D受体和雌激素受体对于钙稳态和维持骨密度具有明确的重要性，糖皮质激素对骨骼有直接和间接的影响，是导致骨质疏松的重要因素[10,11,12,13,14]。还有一些以前被认为与骨代谢无关的核受体，例如雌激素相关受体以及过氧化物酶体增殖激活受体，已被证实对骨形成有作用[15,16,17]。研究发现，过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPAR-γ)是调节成骨的关键，Rev-erba是过氧化物酶体增殖激活受体γ的靶基因[17]。不仅如此，Rev-erba还能够直接调控核心生物节律基因Bmal1的表达[18],Bmal1与骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化过程紧密相关。最近有研究证实在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中孤儿核受体Rev-erbα的表达呈下降趋势[19]，以上均提示Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中可能发挥了一定的作用，由此作者推测Rev-erbα可能参与了骨髓间充质干细胞成骨分化过程。为进一步了解Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用，设计了该实验。

1、材料和方法

1.1设计

细胞对照观察实验。

1.2时间及地点

2018年1月至2019年8月在西南医科大学口颌面修复重建与再生实验室完成。

1.3材料

1.3.1实验动物

4周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠10只，体质量(20±5)g，由西南医科大学动物实验中心提供，合格证号：SYXK(川)2013-065。

1.3.2实验试剂

α-MEM培养基、胎牛血清(Hyclone，美国)；胰蛋白酶、EDTA、β-磷酸甘油酸钠(Gibco，美国)；地塞米松(Gibco，美国)；维生素C(Sigma，美国)；Trizol(Invitrogen，美国)；Real-timeSYBR试剂盒、引物(Takara，日本)；WesternMarker(Fermentas，美国)；SDS-PAGE变性蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天，中国)；Rev-erbα单克隆抗体(Abcom，美国)；GAPDH抗体(Bioworld，中国)；病毒转染所用试剂：T4连接酶、小量抽提试剂盒、大量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、限制性内切酶、200bpladder(上海汉恒生物公司)。

1.3.3实验仪器

OLYMPUSIX70倒置相差显微镜、SANYO高压蒸汽消毒器(日本)；连续波长多功能读数系统、超净工作台(Thermo，美国)；FC204电子分析天平(精确度0.1mg，上海)；BINDERCO2细胞培养箱(德国)；流式细胞仪(BeckmanCoulter，德国)；ABIPRISM7300RT-PCRSystem(ABI);PCR仪、SDS-PAGE及Westernblot相关仪器、稳压DNA电泳仪、数码凝胶处理系统(Bio-Rad公司)；细菌摇床、细菌培养箱(上海一恒实验设备有限公司)；PCR仪(Eppendorf);Positiveclone测序(美季生物技术)；Gilson移液器(Gilson公司)；高速离心机(日立公司)；核酸电泳仪(TOYOBO公司)。

1.3.4细胞来源

获取C57BL/6小鼠胫骨及股骨原代骨髓间充质干细胞悬液，以全骨髓贴壁法培养和纯化小鼠骨髓间充质干细胞，取体外培养的第3代细胞进行实验[19]。

1.4方法

1.4.1表达Rev-erbα基因慢病毒载体的构建及检测

表达Rev-erbα基因慢病毒载体的构建过程包括编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒的制备、病毒的包装浓缩。

(1)目的基因片段的获取与PCR扩增：从DNA文库中调取Rev-erbα基因片段，引物的合成如下——ForwardPrimer:5'-TCTCGAGGCCTGGAATCCTGATT-3';ReversePrimer:5'-GGGATCCAGAGGCTCATCTTGGAATA-3'。以Rev-erbα基因片段为模板行PCR扩增，反应条件如下：95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,68℃延伸2min，循环30次；68℃再延伸10min。扩增的DNA片段行琼脂糖凝胶电泳之后切胶回收提纯。

(2)慢病毒载体线性化与酶切：用XhoⅠ和BamHⅠ对Rev-erbα目的基因和pLVX-IRES-ZsGreen进行双酶切，回收获得Rev-erbα克隆片段和pLVX-IRES-ZsGreen质粒片段。

(3)重组克隆的制备：取酶切好的质粒DNA与载体片段，共同加入TOYOBO高效连接试剂中，4℃连接过夜。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，线性化慢病毒载体转化大肠杆菌感受态细胞，将转化后的菌液在20mmol/LMgSO4和氨苄青霉素抗性的SOB琼脂培养基上均匀涂布，并在37℃下倒置培养16h，形成阳性克隆后进行PCR鉴定，PCR反应体系及循环条件同目的基因片段的PCR扩增。小量抽提质粒送上海桑尼生物技术有限公司测序鉴定。构建好的慢病毒载体需经过大量抽提，质量浓度大于1g/L,A260/280在1.7-1.8之间方可用以包毒。

(4)质粒转染及扩增：将生长状态良好的293T细胞用0.25%胰酶消化，重悬接种于含10mL10%DMEM培养基的T75瓶中，待细胞密度达到80%-90%时，将重组慢病毒质粒plvx-IRES-Zsgreen和包装质粒共转染至293T细胞中，转染后6h换新鲜培养液。

(5)病毒的包装与浓缩：转染后24,48h分别2次收集病毒上清(24h收集后置换新鲜培养液)，以0.45μm滤器过滤，于40mL超速离心管中，4℃72000×g/min离心120min;500μLPBS重悬病毒沉淀，1周内使用则置于4℃冰箱保存，长时间存放则置于-80℃保存。用上述相同方法获得阴性对照慢病毒颗粒。

1.4.2慢病毒转染骨髓间充质干细胞

取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度至2×104/cm2接种于6孔板中，以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基培养，约24h后根据细胞贴壁情况进行换液，每孔加入1mL含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基，40μL含Rev-erbα基因的慢病毒原液(实验组)或40μL仅含EGFP基因的空病毒原液(阳性对照组)，并设立不含病毒原液的阴性对照组，各孔加入转染增强剂polybrene8μL(终质量浓度为8mg/L)，感染复数MOI=30,4h后补齐培养基至正常体积，24h后换液，36-48h荧光显微镜下观察荧光表达情况。

1.4.3慢病毒转染后目的基因的检测

慢病毒转染后48h采用RealTimePCR法与Westernblot法分别检测骨髓间充质干细胞中Rev-erbα在基因水平及蛋白水平的表达。采用以下方法计算实验组及阳性对照组相对于阴性对照组的基因相对拷贝数：

(1)用目的基因的Ct值减去对应内参基因的Ct值，得到各组的ΔCt，求平均值及其标准差。

(2)以阴性对照组为参照，实验组和阳性对照组的ΔCt平均值及其标准差减去阴性对照组的ΔCt平均值及其标准差，得到ΔΔCt值及标准差。

(3)计算出2-ΔΔCt值，得到各组相对于阴性对照组的一个倍数关系，即相对定量。统计各组间的差异性，即求取P值用ΔCt即可。

1.4.4慢病毒转染后成骨诱导并检测成骨分化相关指标的变化

慢病毒转染后48h换为成骨诱导液(α-MEM完全培养基+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50mg/L维生素C+10-7mol/L地塞米松)继续培养，换诱导液的时间记为第0天，采用RealTimePCR检测成骨诱导第0,7,14天时碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达，引物序列见表1。

1.4.5慢病毒转染后成骨诱导及茜素红染色

慢病毒转染后48h换为成骨诱导液继续培养，成骨诱导21d，吸弃培养液，PBS清洗2次，用体积分数为95%乙醇固定30min，吸弃乙醇，PBS清洗3次，加入0.1%茜素红溶液室温染色30min，双蒸水清洗数次，倒置显微镜下观察。

1.5主要观察指标

(1)PCR扩增目的基因产物、阳性克隆PCR鉴定及测序结果；(2)转染后荧光表达及目的基因检测结果；(3)转染后成骨相关指标碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白mRNA的表达；(4)转染后的成骨诱导及茜素红染色结果。

1.6统计学分析

采用SPSS20.0对RealTimePCR等方法所获得的基因表达水平进行方差分析及SNK法进行两两比较，P<0.05为差异有显著性意义。

表1各基因引物序列

2、结果

2.1PCR扩增目的基因产物、阳性克隆PCR鉴定及测序结果

PCR扩增目的基因产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1A，阳性克隆PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳结果见图1B,N代表阴性对照，P代表阳性对照，结果显示14个菌落中3个为阳性克隆。阳性克隆的测序结果显示完全匹配。

图1PCR扩增产物及阳性克隆筛选

图注：图中A为扩增的Rev-erbα片段行琼脂糖凝胶电泳结果；B为阳性克隆后PCR鉴定结果，显示14个菌落中3个为阳性克隆。N代表阴性对照，P代表阳性对照

2.2转染后荧光表达及目的基因检测结果

慢病毒转染后48h荧光表达见图2A，可见感染率达到80%以上。实验组Rev-erbαmRNA水平为阴性对照组的(10.73±1.61)倍，可见转染后Rev-erbα基因转录明显增强，见图2B。实验组REV-ERBα条带明显深染，而阳性对照组与阴性对照组蛋白条带较弱，可判断转染成功，见图2C。

2.3转染后成骨相关指标碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白mRNA表达

在成骨诱导后第0,7,14天分别用RealTimePCR检测成骨相关标志物碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素mRNA水平。碱性磷酸酶表达随成骨诱导时间延长逐渐增加，但实验组与阳性对照组及阴性对照组间比较差异无显著性意义(P>0.05)，见图3。骨桥蛋白表达在第7天较高，而第14天表达减少，但组间比较差异仍无显著性意义(P>0.05)，见图4。骨钙素表达随成骨诱导逐渐增加，但实验组骨钙素表达明显低于阳性对照组及阴性对照组(P<0.05)，说明过表达Rev-erbα抑制了骨钙素的表达，见图5。

图2慢病毒转染后荧光图片及Rev-erbα表达

图注：图中A为转染后48h荧光显微镜下观察荧光表达，可见感染率达到80%以上(×100);B为转染后48hRev-erbαmRNA相对表达(与阳性对照组和阴性对照组比较，aP<0.05);C为转染后48hRev-erbα在各组的蛋白条带图(80kD)

图3各组骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中碱性磷酸酶(ALP)mRNA相对表达

图4各组骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中骨桥蛋白(OPN)mRNA相对表达

2.4转染后成骨诱导及茜素红染色结果

在慢病毒转染48h后经成骨诱导液持续培养21d，实验组与对照组茜素红染色均可见红色矿化结节，但实验组中矿化结节表达明显少于阳性对照组及阴性对照组，见图6，证实Rev-erbα能够抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。

图5各组骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中骨钙素(OCN)mRNA相对表达

图注：与阳性对照组和阴性对照组比较，aP<0.05

图6慢病毒转染后骨髓间充质干细胞成骨诱导结果(×100)

图注：图中A为慢病毒转染后成骨诱导21d，实验组茜素红染色后显微镜下可见少量红色矿化结节；B为阳性对照组显微镜下可见大量红染矿化结节；C为阴性对照组显微镜下可见大量红染矿化结节

3、讨论

该实验成功将Rev-erbα基因转入小鼠骨髓间充质干细胞基因组中并稳定表达，RealTimePCR证明实验组Rev-erbαmRNA表达为对照组的11倍左右。慢病毒毒性小、安全性高、转染后表达稳定的目的基因，是一个很好的转染工具[20,21,22,23,24]。慢病毒转染具有亲嗜性广、炎症反应弱、目的基因可在许多种组织中持续表达等优点[25,26,27]，并且常携带有EGFP荧光，易于观察转染效率。

以往关于Rev-erbα的研究主要集中在其对脂肪生成的影响，关于Rev-erbα和成骨的研究却很少。研究表明，当Rev-erbα过表达时对脂肪生成有积极作用，Rev-erbα在脂肪生成过程中表达增加[28]。而在骨髓中骨髓间充质干细胞成脂能力增加总是伴随着成骨能力的降低，这可能与Rev-erbα表达增加有关。研究人员发现Rev-erbα作为近日节律基因，负调控生物钟基因Bmal1的表达，而Bmal1已被证实与骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化关系密切[28,29]。这些结果均提示核受体Rev-erbα可能在骨代谢过程中发挥着重要作用。作者前期研究证实在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，Rev-erbαmRNA及蛋白水平均呈逐渐降低的趋势[19]。因此设计此实验，通过慢病毒转染使Rev-erbα在骨髓间充质干细胞中过表达，然后观察成骨分化相关标志物的改变。

成骨分化过程大致可以分为3个阶段：细胞增殖、细胞外基质分泌、矿化成熟。碱性磷酸酶是一组与骨形成和组织钙化有关的磷酸单酯水解酶，存在于成骨细胞表面以及矿化形成细胞释放的基质小泡中，与骨的形成及代谢过程相关。碱性磷酸酶能通过水解磷酸酯、ATP及焦磷酸盐，促进Ca2+和无机物结晶沉积而促进矿化过程，是反映细胞分化成熟和成骨能力的早期标志之一[30]。骨桥蛋白是一种高度磷酸化和糖基化的分泌蛋白，可由多种细胞如骨细胞、成骨细胞及破骨细胞等分泌，存在于各种硬、软组织和体液中，尤其在骨骼中含量特别丰富，是生理和病理钙化的关键调节因子[31,32,33]。骨桥蛋白已被证明在多种细胞参与骨重塑过程中发挥着重要作用[34]。在骨重塑过程中，骨桥蛋白主要是在骨形成早期表达，诱导和促进骨髓间充质干细胞的分化和矿化组织的重建。骨钙素是由成熟成骨细胞合成并特异性分泌的非胶原蛋白，占人体总蛋白的1%-2%，与成骨分化及骨代谢密切相关。作为成骨分化的晚期标志物，绝大多数骨钙素都沉积在骨基质中，参与骨矿物沉积和转移的调控，促进成骨细胞分化成熟及骨细胞的形成[35]。在该实验中，选取碱性磷酸酶、骨桥蛋白及骨钙素作为判断骨髓间充质干细胞成骨能力的指标。

实验结果显示Rev-erbα基因成功转入小鼠骨髓间充质干细胞基因组，在整个成骨分化过程中Rev-erbα的表达较为稳定，与对照组相比Rev-erbα呈高表达状态。在成骨分化过程中，RealTimePCR结果显示碱性磷酸酶、骨桥蛋白的表达随着成骨分化的发生逐渐增加；骨桥蛋白的表达在第7天时较高，第14天时有所降低，这与以往众多的研究结果一致。碱性磷酸酶、骨桥蛋白mRNA的表达在组间差异无显著性意义，说明单独过表达Rev-erbα并不能调控成骨早期标志物碱性磷酸酶、骨桥蛋白的表达。过表达Rev-erbα后实验组骨钙素基因mRNA的表达量较对照组明显减少，表明Rev-erbα对成骨分化的调控可能作用于成骨晚期阶段。在成骨诱导后茜素红染色显示实验组与对照组相比红色矿化结节表达减少，表明Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中为负性调控作用。结合骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Rev-erbα的表达呈逐渐降低的现象，提示Rev-erbα可能作为骨髓间充质干细胞成骨分化负性调节因子参与了成骨分化的晚期阶段。

Rev-erbα是昼夜节律的关键调节因子，并以昼夜节律的方式表达。研究发现Rev-erbα配体：内源性卟啉配体、亚铁血红素，以及最近报告的第1个Rev-erb合成配体GSK4112/SR6452能够调节Rev-erbα表达活性[36]。骨髓间充质干细胞成骨分化是一个复杂的、多基因多种通路共同调控的结果，其机制仍需进一步的深入研究。但Rev-erba作为细胞代谢的重要生理调节因子，可能为治疗骨代谢相关疾病的药物治疗提供一个新的方向。

综上所述，实验通过慢病毒基因增强转染的方法将小鼠Rev-erbα基因全片段转入骨髓间充质干细胞基因组中并稳定表达，获得了研究Rev-erbα基因功能的一个体外模型。Rev-erbα转染入骨髓间充质干细胞后，能使成骨晚期标志物骨钙素的表达受抑制，经成骨诱导后茜素红染色显示骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降，说明Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化的晚期阶段有重要作用。基于以上结果，后期研究将进一步设计实验探索Rev-erbα调控骨钙素表达的具体分子机制，为Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中发挥的作用提供进一步的实验证据。

参考文献：

[19]林富伟,徐晓梅,崔琰,等.小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα[J].中国组织工程研究,2018,22(17):2625-2630.

[35]王春玉,龙丰云,陈香,等.骨钙素介导的骨内分泌系统[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2013,6(3):196-202.

张霜,徐晓梅,曾阳,袁小平,林富伟.孤儿核受体Rev-erbα在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用[J].中国组织工程研究,2020,24(31):4921-4926.

基金:四川省医学会项目(S18002),项目负责人:徐晓梅;泸州市科技局基金资助计划(2015-S-50(2/3)),项目负责人:林富伟;西南医科大学附属口腔医院青年课题(201816),项目负责人:林富伟.