胸腺肽是一类双向的免疫调节药，胸腺肽类免疫增强剂的适应证很广，主要用于慢性乙型肝炎患者[1,2]、各种原发性或继发性T细胞缺陷[3]、某些自身免疫性疾病[4]、各种细胞免疫功能低下疾病[5]及肿瘤的辅助治疗[6,7]。胸腺肽肠溶片或肠溶胶囊药品说明书中药理毒理一栏均注明：胸腺肽能促使有丝分裂原激活后的T细胞成熟；增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后各种淋巴因子的分泌，如α、γ干扰素、白介素2(IL-2）、白介素3(IL-3）的产生等。即使是成分单一的胸腺肽α1（日达仙），其说明书中药理毒理一栏也明确注明：本品治疗慢性乙型肝炎或在增进免疫系统反应性方面的作用机理尚未完全查明。但相对于胸腺肽肠溶片而言，胸腺肽α1的作用机制已经研究的相对透彻[8]。

市场上胸腺肽类免疫增强剂主要有胸腺肽、胸腺五肽、胸腺法新（胸腺肽α1)[9]、转移因子和脾氨肽。《中国药典》二部（2015版）收录了胸腺五肽和胸腺法新这两个品种，含量测定采用高效液相色谱法，其他三类药品（胸腺肽，转移因子，脾氨肽）均未收载，这三类药品的检验方法主要参照现行国家药品标准，即采用T细胞活性测定法-脱E受体法（E-玫瑰花结试验）进行活性检验。

E-玫瑰花结试验中，国家药品标准采用猪和绵羊作为实验材料，猪和绵羊非常规实验动物，饲养期间用药情况，饲养、繁殖、品系、品种和遗传背景，以及检验检疫等均无从得知。这些情况使试验体系获得的猪胸腺T细胞和绵羊红细胞的质量无法得到保证。因此，本研究将E-玫瑰花结试验中的T细胞和红细胞的动物来源更换为国家认可、有质量保证且易获得的常规实验动物（如豚鼠和兔），同时考虑到实验动物的3R原则，基于玫瑰花结试验的原理是T细胞与绵羊红细胞的结合，且胸腺肽可促进T细胞成熟，选取1株未成熟的人源T细胞系-Jurkat细胞作为E-玫瑰花结试验中T细胞来源进行尝试，同时优化了脱E条件、给药时间、给药浓度、细胞浓度，有望达到提高试验质量、降低试验成本、提高工作效率、节省检验机构和企业的人力、物力、财力的目的。

1、材料与方法

1.1细胞

Jurkat细胞购自中科院上海细胞库。

1.2主要试剂及仪器

胸腺肽肠溶片购自哈高科白天鹅药业集团有限公司；转移因子口服液购自沈阳一天生物制药有限公司；胸腺肽肠溶胶囊购自上海宝龙药业有限公司；注射用胸腺法新购自意大利赛生制药有限公司；无菌脱纤维绵羊血由上海市疾病预防控制中心提供；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司；1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；细胞活力分析仪（ViCellXR）购自美国贝克曼库尔特。

1.3实验动物

普通级新西兰兔，雄性，体重1.7～2.5kg，购自上海科硕实验动物有限公司，动物合格证号：311618200001014;SPF级Hartley豚鼠（雄性，2～10周龄，动物合格证号：11400700239432）和SPF级SD大鼠（雄性，体重190～230g，动物合格证号：11400700227429）购自北京维通利华实验动物技术有限公司；巴马小型猪，约60日龄，购自上海甲干生物科技有限公司。

1.4溶液配制

Hank’s液：将0.3%磷酸二氢钾溶液、0.76%磷酸氢二钠溶液、2%氯化钾溶液及20%氯化钠溶液依次按20∶20∶20∶40比例混合，加入1g葡萄糖，溶解混匀，用水稀释至1000mL，并用4%碳酸氢钠溶液调节pH至7.2～7.3（临用时配制）；阿氏液：取氯化钠0.420g、枸橼酸0.055g、枸橼酸钠0.766g、葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100mL，灭菌后使用。

1.5T细胞及红细胞的结花性试验

1.5.1实验动物来源细胞的结花性试验

取大鼠和豚鼠胸腺，用淋巴细胞分离液分离T细胞，用Hank’s液调整至浓度为3×106～5×106个/mL的细胞悬液。取大鼠血（采血部位为腹主动脉）、兔血（采血部位为心脏）、豚鼠血（采血部位为心脏）和无菌脱纤维绵羊血作为红细胞来源，调整浓度为T细胞浓度的10倍。分别取0.2mL上述T细胞悬液与0.2mL上述红细胞悬液，混合后37℃孵育1h，显微镜下观察结花情况。

1.5.2Jurkat细胞的结花性试验

将Jurkat细胞调整至浓度为3×106～5×106个/mL的细胞悬液。取无菌脱纤维绵羊血，调整浓度为Jurkat细胞悬液浓度的10倍。取0.2mLJurkat细胞悬液与0.2mL绵羊红细胞悬液混合后，37℃孵育1h，显微镜下观察结花情况。

1.6E-玫瑰花结试验方法

具体参照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS1-(X-001)-2002Z。

1.6.1脱E胸腺细胞制备

取新鲜胸腺（豚鼠或猪），用淋巴细胞分离液分离出T细胞后（Jurkat细胞不用淋巴细胞分离液分离，直接使用），45℃恒温水浴孵育30min;Hank’s液洗涤1次后，经45℃恒温水浴孵育30min，共2次，累计60min，脱去T细胞表面E受体；用Hank’s液调整成浓度为3×106～5×106个/mL的细胞悬液。

1.6.2红细胞悬液制备

取适量红细胞（兔或绵羊红细胞），用Hank’s液洗涤后调整成浓度为脱E胸腺细胞浓度8～10倍的细胞悬液。

1.6.3胸腺肽溶液的制备

取胸腺肽样品（胸腺肽肠溶片、转移因子口服液、胸腺肽肠溶胶囊、注射用胸腺法新），用Hank’s液配成1mg/mL的溶液。

1.6.4测定

取1.5mLEP管6支，3支各加Hank’s液0.1mL作为对照管，3支各加胸腺肽溶液0.1mL作为样品管，每管加脱E胸腺细胞悬液0.2mL,37℃孵育1h；加入红细胞悬液0.2mL，摇匀，500r/min离心3min后4℃过夜；取出固定，用吉姆萨染色后计数淡蓝色的淋巴细胞（不少于200个），统计其中的玫瑰花结形成数（结合3个以上红细胞的淋巴细胞），取平均值，即为样品管或对照管的平均值。

1.6.5结果判定

胸腺肽样品活力（样品管玫瑰花结百分率-对照管玫瑰花结百分率），应大于10.0%。

1.7豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞玫瑰花结试验

参照1.5项方法，选取豚鼠胸腺作为1.5.1项中的胸腺细胞来源，兔血作为1.5.2项中的红细胞来源。

1.7.1试验条件的优化

1.7.1.1豚鼠周龄的选择

选取2、4～7和10周龄豚鼠，参照1.5项方法，分离胸腺，提取T细胞，比较T细胞结花率。

1.7.1.2脱E方式的选择

对提取的豚鼠胸腺T细胞，采用脱E和不脱E方式处理，比较胸腺肽样品的活力。

1.7.1.3兔红细胞保存方式的选择

将兔血分别用玻璃珠脱纤维和阿氏液抗凝保存，比较红细胞存活率。

1.7.2试验条件的验证

根据筛选出最佳试验条件，参照1.5项方法，选取4个不同厂家不同剂型的胸腺肽样品（胸腺肽肠溶片、转移因子口服液、胸腺肽肠溶胶囊和注射用胸腺法新）进行活力测定。同时按国家药品标准WS1-(X-001)-2002Z方法（选取巴马小型猪和无菌脱纤维绵羊血作为T细胞和红细胞来源）对上述4个胸腺肽样品的活力进行测定，比较豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞玫瑰花结试验方法与经典的猪胸腺T细胞-绵羊红细胞玫瑰花结试验方法检测出的样品活力的差别。

1.8Jurkat细胞-绵羊红细胞玫瑰花结试验

1.8.1试验组合的灵敏性

参照1.5项方法，选取Jurkat细胞作为步骤1.5.1项中的T细胞来源，无菌脱纤维绵羊血作为1.5.2项中的红细胞来源。选取胸腺肽肠溶片进行活力测定，确定试验组合对样品的灵敏性。

1.8.2脱E时间、给药浓度及给药时间的优化

参照1.5项方法，将培养的Jurkat细胞用Hank’s液洗涤1次后进行脱E操作，分别在45℃孵育10、15、20、30和45min，确定最佳脱E时间；选择不同浓度（0.01、0.1、1、1.5和2mg/mL）的胸腺肽样品，确定最佳给药浓度；选择不同给药时间（37℃孵育60、90和120min），确定最佳给药时间。

2、结果

2.1豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞玫瑰花结试验

2.1.1实验动物来源细胞的结花性

镜下观察发现，仅豚鼠胸腺T细胞与兔红细胞之间可以相互结合，形成玫瑰花结，见图1，其他组合中，T细胞与红细胞完全孤立存在，两者间未结合。

2.1.2最佳试验条件

确定豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞玫瑰花结试验的最佳试验条件为：选取4～7周龄豚鼠胸腺T细胞，45℃孵育1h脱去E受体，用阿氏液保存兔红细胞。见表1。

2.1.3试验条件的验证

结果显示，同时进行的猪胸腺T细胞-绵羊红细胞的组合，每种样品均可满足标准规定活力大于10%的要求，但采用改进的豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞的组合时，仅转移因子口服液及注射用胸腺法新的活力高于10%，但仅为10.7%，见图2。随后采用豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞的组合对转移因子口服液及注射用胸腺法新进行复试，但也仅达到5%的活力。

2.2Jurkat细胞-绵羊红细胞玫瑰花结试验

2.2.1Jurkat细胞的结花性

结果显示，将Jurkat细胞与绵羊红细胞按1∶10的比例混合，两者可形成玫瑰花结，且Jurkat细胞的直径大于猪胸腺T细胞，可结合更多的红细胞，形成的玫瑰花结看起来更大，更清晰，更利于观察者计数，见图3。

2.2.2试验组合的灵敏性

45℃脱E60min后，对照管结花率下降了11.01%，表明该脱E条件可大幅降低Jurkat细胞表面的E受体水平，是一种有效的脱E方法；孵育胸腺肽后结花率提高，但幅度不大，表明该方法在脱E条件、给药条件上可继续优化。见表2。

2.2.3试验条件的优化

结果显示，脱E10～45min期间，脱E30min时样品活力最佳，其他时间点活力较低，有时甚至出现负值，见图4。

在45℃脱E30min条件下，胸腺肽浓度为0.01mg/mL时，样品活力并不高于浓度为1mg/mL时，且随着药物浓度升高至超过1mg/mL时，样品活力有下降趋势，见图5。

45℃脱E30min、给药浓度1mg/mL条件下，给药时间对样品活力影响不大，Jurkat细胞虽然可与绵羊红细胞结合，但此方法未能较好地反映出样品的活力，见表3。

图1豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞玫瑰花结试验的显微镜观察（×200)

表1豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞玫瑰花结试验条件的优化

图2不同厂家的胸腺肽制品试验结果

图3Jurkat细胞-绵羊红细胞（A）及猪胸腺T细胞-绵羊红细胞（B）玫瑰花结试验的显微镜观察（×400)

表2试验组合的灵敏性试验

图4不同脱E时间对Jurkat细胞结花率的影响

图5不同给药浓度对Jurkat细胞结花率的影响

表3不同给药时间对Jurkat细胞结花率的影响

3、讨论

胸腺肽主要作为一种免疫增强剂来辅助肿瘤治疗，虽然有大量文献报道肯定其效果[1,2,3,4,5,6,7]，但也有文献提示，此类免疫增强剂联合化疗与单纯化疗前后相比，免疫功能未发生变化[10]。人体的免疫调节机理非常复杂，因此免疫调节药的免疫活性测定方法始终是一个难题。总体来说，可以通过测定T细胞活力来间接反映药物的活性。从20世纪80年代的玫瑰花结试验至21世纪初流式细胞法，均有各自的优点[11]。考虑到试验的方便性、快捷性及节约性，胸腺肽在药品标准中的活性检验方法一直是E-玫瑰花结法，此法通过比较样品管与对照管E-玫瑰花结百分比即可计算出药品的活力值。有研究表明，T细胞在体外重新形成E-玫瑰花结的能力依赖于细胞代谢的转录、翻译及蛋白质的合成[12]。淋巴细胞结花能力的恢复也是一个非常复杂的过程。有文献报道，经胰酶消化处理后，人淋巴细胞与绵羊红细胞结合E-玫瑰花结的数量会降低，但消化后的细胞与免疫刺激药（如左旋咪唑）共孵育后结花能力可以恢复[13]。此外，研究人员发现，与不同浓度药物孵育时淋巴细胞结花能力的恢复机理是不同的，在低浓度孵育时药物可刺激细胞代谢，高浓度孵育时药物可增加细胞间黏附[14]。针对猪T细胞的研究表明，E受体在淋巴细胞表明呈点状均匀分布，胰蛋白酶处理使细胞表面E受体消失，经培养后可逐渐自发重建；正常情况下静止的淋巴细胞内E受体的合成水平很低，小牛胸腺肽制剂处理可促进E受体在细胞质内合成，加速其表达过程[15]。也有文献报道，黄芪水提物可对T细胞经胰酶损伤的E受体有明显的修复作用，能使损伤、脱落的E受体重新恢复[16]。鉴于猪淋巴细胞E受体与人E受体具有许多相似的性质[15]，国家药品标准中胸腺肽的活性检验方法从最初的人脐带血T细胞-绵羊红细胞的组合逐渐优化至目前的猪胸腺T细胞-绵羊红细胞组合，只不过将较难获得的人源T细胞用类似的猪源T细胞代替，这也表明，E-玫瑰花结方法稳定，能反映出与药品孵育后T细胞表面E受体水平的变化，也能间接反映出药品的免疫增强功能。

有些研究人员在研究T细胞分类时发现，豚鼠T细胞（外周血来源：TBL；胸腺来源：Th）可与兔红细胞结合成玫瑰花结，冻融或者用代谢抑制剂可破坏TBL表面受体，但对Th表面受体无影响[17]。一些研究人员采用豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞的组合进行药品活性测定[18,19]，但试验条件上均有一些未解决的问题。在试验条件优化方面，也有不少研究成果[19,20,21,22]，涉及离心方法、计数方法、淋巴细胞与绵羊红细胞的比例、Hank’s液pH等，但这些文献中的试验大多均是80年代进行的，也仅是对试验方法进行了优化。在尝试了各种实验动物T细胞与红细胞的组合后，本研究发现，豚鼠胸腺T细胞与兔红细胞可以结合，这也与文献报道一致[23,24]，虽然对试验条件进行了优化，但发现此组合对样品的反应性不如猪胸腺T细胞-绵羊红细胞的组合。

E-玫瑰花结试验方法最早是通过绵羊红细胞与人淋巴细胞的结合来标记/区分T细胞[17]，但由于人血来源有限且涉及伦理问题，国家药品标准中E-玫瑰花结方法中的T细胞来源逐渐由最初的人源（脐带血）转变为猪源（猪胸腺），但随着细胞生物学的发展，不断有人源的细胞系被建立，其中不乏许多T细胞系，如A3、Jurkat、Reh、HuT78等，其中Jurkat细胞株来源于一个14岁男孩的外周血，是未成熟的T细胞，可以表达T细胞抗原受体，因此选用Jurkat细胞作为T细胞的来源。与传统实验动物来源的T细胞相比，Jurkat细胞具有很多优点：来源于人体，无物种差异，可与绵羊红细胞形成玫瑰花结；可不断传代扩增，试验成本较低；操作简单，方便快捷。本研究虽然进行了各种条件的优化，但发现此组合对样品的反应性不如猪胸腺T细胞-绵羊红细胞的组合。

针对胸腺肽类免疫增强剂的活性检验方法（E-玫瑰花结试验），本研究进行了实验动物及细胞系的探索，虽然发现豚鼠胸腺T细胞-兔红细胞与Jurkat细胞-绵羊红细胞的组合均可形成玫瑰花结，但这两种组合对样品的反应性均不如猪胸腺T细胞-绵羊红细胞的组合，因此，这两种组合尚不能用于胸腺肽类免疫增强剂的活性检测，需进一步优化。

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