首页 > 论文范文 > 自然科学论文 > 生物学论文 > 细胞学论文 > 探究贴壁细胞形态和超微结构与固定方式的关联性

探究贴壁细胞形态和超微结构与固定方式的关联性

2020-06-19 204 上传者：管理员

摘要：为探索和优化贴壁细胞透射电镜制样方法,本试验以鼠肾细胞系HEK293和小鼠成纤维细胞系3T3的贴壁培养细胞为材料,采用三种不同的固定方法,分别为先固定后刮取细胞、先刮取细胞后固定和胰蛋白酶消化后固定,对细胞进行固定和收集,于光学显微镜下观察细胞形态变化并进行电镜样品的制备,比较不同固定方式下细胞形态和超微结构的差异。结果表明,先固定后刮取法能较好保持贴壁细胞原始形态特征,而先刮取后固定法和胰酶消化法都会明显改变贴壁细胞形态,使悬浮起的细胞呈近似球形。在电镜下,三种方法都可以得到良好的超微结构,先固定后刮取的细胞形态更贴近于生理状态,但是其长条形或梭形的形态特征也给细胞超微结构的观察带来一定困难;先刮取后固定法和胰蛋白酶消化法得到的细胞呈圆球形,观察更为方便,但细胞的形态与贴壁时的生理状态不符。本试验为贴壁细胞电镜制样的基础方法研究,为不同的细胞学实验选择适当的前固定处理方式提供了科学的依据。

关键词：
固定
细胞刮取
细胞学
细胞形态
贴壁细胞
贴壁细胞电镜
超微结构
加入收藏

贴壁培养的细胞是透射电镜制样中常见的样品之一，贴壁细胞透射电镜制样的前处理方法主要有三种:原位包埋法、刮除离心法和消化离心法[1,2,3]。原位包埋法，是将细胞培养在玻璃或塑料载片上，然后连同载片一起进行固定、脱水、渗透和包埋，适用于单层细胞，以观察细胞原有形貌和细胞间的连接关系[4,5]。除原位包埋的方法外，其它方法都需要将细胞样品悬浮和固定后，才能进行下一步制样操作。刮除离心法通常是将培养的贴壁细胞用细胞铲轻轻刮下，然后离心成米粒状的小团块。根据戊二醛固定的顺序不同，刮除离心法又可以分为先固定后刮取和先刮取后固定[6]两种不同的方法。消化离心法是将培养的细胞用胰酶消化下来，收集离心团块[1,3]。三种不同的细胞处理方法各有优缺点，原位包埋法虽然可以较大程度保持细胞的贴壁生长状态，但操作相对复杂，尤其是单层细胞的切片环节技术性较强[4];刮除离心法和消化离心法较为简便，其中刮除离心法是细胞样品的常规电镜制样方法，但这两种方法都可能使细胞失去正常的生理状态，并对细胞的原始形状和结构造成一定破坏[7]，其中，消化离心法由于对细胞造成的影响较大，目前已经较少应用于电镜实验。

为比较细胞先固定后刮除法和先刮除后固定法这两种常规的贴壁细胞处理方法以及胰酶消化法对电镜制样结果的影响，本论文采用上述三种方法，对贴壁培养的鼠肾细胞HEK293和小鼠成纤维细胞3T3进行光学显微镜和透射电镜的制样与观察。

1、材料与方法

1.1细胞培养

用含有10%FBS、1%青链霉素双抗的高糖DMEM培养基培养HEK293细胞和3T3细胞。待细胞长至80%汇合度时，置于倒置显微镜(OlympusIX71)下观察并记录活细胞的贴壁形态，之后采取下述不同方法进行细胞的收集。

1.2细胞收集

1.2.1先固定后刮取收集法

用吸管轻轻移去培养液，磷酸缓冲液(PB,0.1mol·L-1,pH7.4)冲洗细胞，吸去磷酸缓冲液后，迅速加入2.5%戊二醛，室温固定2h，固定后于倒置显微镜(OlympusIX71)下观察并记录固定后细胞的形态，用细胞铲将固定后的细胞轻轻刮下，连同固定液一起收集于15mL离心管，离心速度3000r/min，离心3min，弃上清后收集细胞团块，加入新鲜戊二醛固定液，放入4℃冰箱中保存。取少量固定后的细胞，滴于载玻片上，倒置显微镜下观察并记录刮下细胞的形态。为比较固定时间对刮取后细胞形态的影响，部分3T3细胞样品于固定5min后刮取，并按上述方法进行处理。

1.2.2先刮取后固定收集法

用细胞铲将贴壁细胞轻轻刮下，在倒置显微镜下观察并记录刮下后游离细胞的形态。将刮下的细胞连同培养液一起收集于离心管，离心，弃上清，PB清洗后加入2.5%的戊二醛，室温固定2h,4℃保存。

1.2.3胰蛋白酶消化法

吸干培养皿中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS,1×，ThermoScientific)清洗一次，吸掉PBS，再使用0.05%含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃下消化1min，在显微镜下观察，待细胞鼓起呈单个排列时，加入含有10%FBS的高糖DMEM培养基，终止消化反应，用移液器打散细胞，在倒置显微镜下观察并记录消化下的游离细胞形态，离心收集和固定保存同上述1.2.2中步骤。

1.2.4培养细胞的电镜样品制备

固定后离心的细胞团用2%低熔点琼脂糖进行预包埋[8]，切成1mm3的小块，用磷酸缓冲液(PB,0.1mol·L-1,pH7.4)漂洗3次后，1%锇酸4℃下后固定1h。分别用浓度为50%、70%、90%的乙醇以及等比例混合的90%乙醇和90%丙酮水溶液，90%丙酮依次梯度脱水，每个梯度10min,100%丙酮脱水3次，每次5min。

样品彻底脱水后，用包埋剂(环氧树脂，EMBED812EMBEDDINGKIT,ElectronMicroscopySciences)浸透，纯丙酮:包埋剂(1∶1)室温1h，纯丙酮:包埋剂(1∶2)室温1h，纯包埋剂2h，再换一次纯包埋剂，37℃烘箱内过夜。第二天将烘箱温度调至45℃，12h,60℃聚合48h。聚合好的包埋块用单面刀片粗修后，在超薄切片机(LeicaEMUC7，徕卡)上用钻石刀(UltraDiamondKnife，瑞士戴通)进行超薄切片，切片收集在有支持膜的铜网上，厚度为70nm。经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在透射电镜下观察并采集图片(JEM-1230,JEOL;GatanOrius8300)。

2、结果

2.1不同固定方法对细胞形态的影响。

贴壁培养的鼠肾HEK293细胞，紧贴培养皿生长，细胞呈纺锤形，具有少量向周围伸出的伪足样结构，细胞之间存在连接(图1a，图1b)。采用先固定后刮取方法，加入2.5%戊二醛固定2h后，未见细胞形态发生明显变化(图1c)。将固定后的细胞用细胞铲轻轻铲下后置于倒置显微镜下观察，可发现细胞有明显的团聚现象，但细胞形态仍然保持纺锤形的形态特征和伸出的伪足样结构(图1d)，将细胞收集于离心管中，进行离心处理，可以发现离心下的细胞沉淀呈蓬松的絮状，不易离心紧实(图1d*)。采用先刮取后固定的处理方法，用细胞铲刮下的HEK293活细胞，在脱离贴壁状态后，迅速变形，呈卵圆形或圆形，伪足样结构消失，细胞团聚在一起呈块状分布(图1e)，使用戊二醛固定后，细胞仍然保持卵圆形或圆形的形态特征，离心处理后的细胞呈紧实的块状(图1e**)。

胰酶消化后的鼠肾HEK293细胞在脱离贴壁状态后，迅速变形为卵圆形或圆形，伪足样结构消失，游离于培养液中(图1f)，戊二醛固定后细胞仍然保持这样的形态特征，离心处理后的细胞呈紧实的块状(图1f***)。

小鼠成纤维细胞3T3贴壁生长时，细胞呈梭形，排列极紧密(图2a)。采用先固定后刮取方法，加入2.5%戊二醛固定5min后，细胞形态未发生明显的变化(图2b)，将细胞刮下后，可见细胞聚集呈片状分布，细胞仍呈梭形，细胞之间保持贴壁状态下的紧密排列(图2c)。2.5%戊二醛固定2h后，所表现出的特点与固定5min后的细胞类似，细胞形态无显著变化，呈梭形，细胞刮下后，聚集呈片状分布，细胞形态仍为梭形(图2d)，离心后，细胞沉淀呈絮状。采用先刮取后固定的处理方法，用细胞铲刮下的3T3活细胞，在脱离贴壁状态后，呈片状分布(图2e)，细胞形态由梭形转变为卵圆形或圆形(图2e*)，使用戊二醛固定后，细胞仍然保持卵圆形或圆形的形态特征，离心处理后的细胞呈紧实的块状。

胰酶消化后的3T3细胞在脱离贴壁状态后，原本紧密分布的细胞分散呈单个分布，细胞形态变为卵圆形或圆形(图2f)，戊二醛固定后细胞仍然保持这样的形态特征，离心处理后的细胞呈紧实的块状。

2.2不同固定方法对细胞电镜观察的影响

对采用不同方法收集的细胞分别进行电镜制样和观察，结果发现先固定后刮取方法获得的HEK293细胞在超微切片上多呈现梭形或长条形的细胞形态，分布较为稀疏。由于细胞呈长条状(图3a)，在中低倍下(5000×)，难以对细胞整体进行拍摄，需要将放大倍数调整至2000×～3000×左右才能进行完整细胞的拍摄，这给细胞的整体观察带来许多不便。采用先刮取后固定法(图3b)和胰酶消化法(图3c)得到的HEK293细胞的形态多呈圆形或卵圆形，细胞分布较为密集，通常数个细胞紧贴在一起，在中低倍下(5000×)，可以对细胞整体进行拍摄。三种制样方法得到的细胞，其线粒体、内质网、细胞核等超微结构均清晰可辨，未发现有明显的细胞损伤(图3d～f)。

图1不同方法固定后，鼠肾HEK293细胞的形态变化。

图2不同方法固定后，小鼠成纤维3T3细胞的形态变化。

在电镜下，采用先固定后刮取方法，分别固定5min(图4a,4b)和2h(图4c,4d)后刮下的3T3细胞，在形态和超微结构上没有明显的差异。在形态上，先固定后刮取的细胞均呈现梭形或长条形，分布较为稀疏(图4a,4c)。在超微结构方面，细胞胞体内的细胞器，如线粒体、高尔基体、内质网以及细胞核等结构清晰，未发现有明显的细胞损伤(图4b,4d)。采用先刮取后固定方法(图4e,4f)和胰酶消化法(图4g,4h)得到的3T3细胞类似，在电镜下多呈圆形或卵圆形，细胞分布较为密集，通常数个细胞紧贴在一起(图4e,4g)，细胞内线粒体、内质网等超微结构清晰可辨，无明显细胞损伤(图4f,4h)。

图3HEK293细胞透射电镜图片，分别采用先固定后刮取法(a和d)，先刮取后固定法(b和e)和胰酶消化法(c和f)进行处理。N:细胞核;ER:内质网;Mt:线粒体。a-c:Bar=5μm;d-f:Bar=1μm

3、讨论

贴壁细胞的固定与收集是其电镜制样的重要步骤，其中原位包埋法是对贴壁细胞原始形态与结构保存较为完好的一种方法[4,5,9,10]，在观察一些特殊结构如神经元细胞间的突触前后连接、神经元细胞的起始和终末、长/短突起、囊泡的空间分布以及追踪某特定细胞等实验中发挥着重要作用，Aclar和Thermanox塑料薄膜的出现很大程度上简化了原位包埋法的制样流程[4]，但相对于常规制样方法仍显繁琐，尤其切片环节中对样品切面定位和抗静电要求较高，并不适合作为大批量常规细胞的制样方法使用。细胞刮除法，包括先固定后刮除和先刮除后固定两种方法是目前电镜细胞制样中最常用的方法，胰酶消化法虽然目前已经较少使用，但仍可作为贴壁细胞前处理的方法之一[1,2,3,6]。

本文选择贴壁生长的鼠肾细胞HEK293、小鼠成纤维3T3细胞作为样品，分别采用上述三种方法进行细胞固定和收集，通过光学显微镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构差异，其中HEK293属于上皮细胞，而3T3细胞属于成纤维细胞。结果发现无论是上皮细胞还是成纤维细胞，采用先固定后刮除方法处理，在刮除之前，细胞形态基本没有明显变化，固定后的细胞即使仅仅固定5min，刮下后仍能基本保持贴壁时的形态特点，而先刮除后固定和胰酶消化法处理后，细胞形态发生了明显的变化。推其原因，对于先固定后刮除方法处理的细胞，戊二醛已将贴壁状态下细胞中的蛋白质和糖类等物质交联固定，固定后的细胞在被刮下时也就不会发生明显的变形。采用先刮除后固定和胰酶消化法处理的细胞，在离开贴壁状态后，仍是活细胞，在失去贴壁支持的情况下会迅速发生变形，此时再将细胞固定，只能获得游离后变形的细胞，而无法保留细胞的原始贴壁形态。从超微结构看，三种不同固定方法得到的细胞，不论是上皮细胞或成纤维细胞，它们的细胞核、核膜、内质网、线粒体、细胞膜等细胞器的结构都较为清晰，没有明显的区别。

图43T3细胞透射电镜图片。

如上所述，在电镜制样过程中，三种样品处理方法都可以得到较好的超微结构图像。先固定后刮除法，相较于另外两种方法，得到的细胞更接近其贴壁时的形态和生理状态，但也存在一些问题。首先采用这种方法得到的细胞团块整体呈蓬松的絮状，难以离心成紧实的团块(图1d，插页*)。长条形的细胞形态可能在离心过程中形成了网络结构，而阻止了细胞团块被进一步离心紧实。这也造成了在电镜下看到的细胞密度相对较低的现象(图3a，图4a和4c)。其次，由于细胞整体呈梭形或长条形，在中低倍(5000～10000×)电镜下，难以将细胞完全纳入视野之下，而在更低的倍数下，成像的分辨率不足以识别细胞内部的结构。这样的细胞形态给需要进行细胞器统计分析的实验带来了一些不便。另外，在一些实验中，先固定后刮除的方法，还可能将细胞外基质与细胞交联固定在一起，难以将其去除。而先刮除后固定和胰酶消化法得到的细胞可以离心为较为紧实的团块，得到的细胞密度高，同时圆形胞体在电镜下容易放入同一个视野(图4e和4g)，更容易对细胞内各细胞器的超微结构进行比较观察。

总体而言，先固定后刮除得到的细胞形态和结构更接近于细胞的贴壁状态，而先刮除后固定和胰酶消化法得到的细胞，虽然偏离了正常贴壁细胞的形态，但细胞密度相对较高，观察也相对方便。因此，采用何种细胞样品的收集与固定方法最好根据实验者的具体要求来确定，如对细胞的形态观察要求甚高的试验宜采用先固定后刮除的方法，而对形态要求不高，以观察细胞内细胞器的超微结构为主的试验，可以采用先刮除后固定的方法。

参考文献：

[1]范京川,王红,徐晨,等．离心速度及时间对培养细胞透射电镜样品制备的影响[J]．重庆医科大学学报,2009,34(8):1008-1010．

[2]杨怡,张飒,周涛,等．培养细胞电镜样品制备方法[J]．解剖学杂志,2003,2(5):509-510．

[3]潘晓蔚,王嘉伦．培养细胞透射电镜标本制作方法的改进[J]．沈阳医学院学报,1997,11(3):51-52．

[4]潘立君,何苗,张宾,等．神经元单层细胞电镜原位包埋方法的探讨[J]．中国细胞生物学学报,2016,38(12):1512-1517．

[5]翟楠,吴轶成,陈新宇,等．少量贴壁培养细胞电镜原位包埋方法的探讨[J]．中国细胞生物学学报,2014,36(12):1649-1651．

[6]杨怡,张德添,张飒,等．培养细胞透射电镜超薄切片制备方法[J]．电子显微学报,2004,23(4):506-506．

[7]赵刚,曾嘉,杨海贤．培养细胞的超薄切片技术探讨[J]．天津医科大学学报,2004,10(2):168-172．

[8]白焕红,付洪兰,马淑芳．琼脂铸模法制备透射电镜样品[J]．电子显微学报,2001,20(1):76-78．

[9]杨怡,张飒,周涛,等．透射电镜观察特定原位培养细胞样品的制备[J]．军事医学科学院院刊,2003,27(5):20-21．

[10]钱晶晶,管怀进,朱昌来.体外培养细胞原位包埋电镜样品的制作方法[J].南京医科大学学报(自然科学版),2013,33(5):707-708.

王旭,孔妤,杨侃,王玲玲,张宾.不同固定方式对贴壁细胞形态和超微结构的影响[J].电子显微学报,2020,39(01):79-85.