颌面部骨是支撑面部、修复美容的基础,其中颞下颌关节是人面部唯一一对联动关节,一侧受损即可导致张口受限、面部发育畸形等症状,而较常见的颞下颌关节的损伤包括关节盘穿孔、关节盘磨损关节强直,最后导致发育、错牙合畸形。最初由Frost[1]发现骨改建的开始由破骨细胞激活,并按照静止期、激活期、吸收期、逆转期和成骨期循序进行,一般3～5个月完成。自体或异体骨移植虽然可行,但也存在诸多问题[2]。骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白中具有促进细胞趋化、增殖和向成骨途径分化以及细胞外基质产生,蛋白质分泌和矿化的作用[3,4]。血管内皮生长因子是促进血管生成的最强因子,并可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化。慢病毒属于病毒载体,可以稳态转染目的基因[5]。本实验前期已经成功印证了BMP-2促成骨分化的作用。本研究通过联合双基因转染研究BMSCs分化诱导成骨,并为进一步研究成骨速度,防止损伤愈合过程中过度成骨提供量化参考。

1、材料与方法

1.1实验动物

中国青山羊,雌雄各半,体重约32kg,年龄32个月(由新疆医科大学动物实验室提供)。

1.2主要材料与仪器

特级胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素、链霉素、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、速新眠注射液、利多卡因、氯化钠注射液、抗坏血酸、免疫组化试剂盒、RT-PCR试剂盒、RT-PCR仪;茜素红染液(pH=8.3)、碱性磷酸酶染色液(北京雷根生物);碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物);胰蛋白酶(Sigma);Ⅱ型胶原酶(Sigma);DMEM培养基(Gibco);Ham’sF12培养基(Gibco);Ⅱ型胶原多抗(Chemicon);羊抗OC多克隆抗体;二甲基亚砜(DMSO,Sigma);四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma);超净工作台、CO2孵箱(SanYoMCO-15AC);离心机(Anke70L-50B);倒置相差显微镜(OLYMPUS,IX70);倒置荧光显微镜(Nikon公司,日本);慢病毒购自美国SystemBiosciences公司,哺乳动物抗体BMP-2、VEGF-165均由乌鲁木齐格林金诺生物科技公司提供,所有器械及培养用液等均无菌处理后备用。

1.3方法

1.3.1全骨髓贴壁法分离培养山羊BMSCs实验前1周进行饲养,实验前3d测量山羊体温、脉搏、心率等指标,术前6h禁食水采用速新眠0.05mL/kg进行麻醉,麻醉生效后用含有肝素的16号穿刺针取山羊髂前上棘处骨髓液,离心后获得BMSCs,以含体积分数为10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的低糖DMEM培养液重悬,以1×109/L细胞浓度接种于底面积为25cm2的培养瓶中,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,24h后换液,以后每3d换1次,待贴壁细胞融合率达到80%时,按1∶2的比例传代。

1.3.2显微镜观察倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖情况、基质的分泌、细胞形态的变化等。

1.3.3茜素红染色检测细胞成骨诱导分化,准备细胞培养至第3代,按照5×105个/孔接种于24孔板上,在原培养基中加入成骨诱导液500μL(L-DMEM完全培养液加入1×10-7mol/L地塞米松、50mg/L维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠),放置于培养箱中,隔天更换诱导液,在培养7、14、21d时洗去诱导液,PBS冲洗2次,4%多聚甲醛固定500μL(24孔板)固定30min。吸去固定液,加入0.5%的茜素红染液500μL,染色20min。冲洗去除残留的染色液;加入PBS,完成染色。

1.3.4MTT从接种后第1天起,每天用MTT法检测细胞增殖活性(图1),共7d。用酶标仪在490nm波长下检测每孔A值,取均值并绘制生长曲线。记录并与转染后进行对比。

1.4细胞转染和实验分组

1.4.1细胞的准备

转染前24h,取第2代BMSCs细胞用0.25%胰蛋白水解酶消化后制成细胞悬液,计数并调整细胞的浓度达4.2×105/mL接种于12孔板中,每孔4mL,37℃和5%CO2浓度条件下过夜培养,第2、天待细胞生长融合至95%时准备待用。

1.4.2慢病毒感染预实验

(1)用带荧光标记的慢病毒(LV-GFP)进行感染预实验,设置感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为1～50,2～2.5倍梯度;(2)转染后第4天在荧光显微镜观察细胞;(3)转染效率的计算:在100倍下测量10个均匀分布的视野,并计算每个视野内的细胞总数和转染阳性细胞数:10个视野转染阳性细胞数之和/细胞总数之和=细胞转染效率;(4)当MOI=40时,转染效率达95%;设置为最优感染复数(图1);(5)在预实验中加入聚凝胺以增强感染。

图1感染复数为40时慢病毒感染BMSCs的效果(×5)

1.4.3重组慢病毒转染BMSCs细胞

本实验分为4组:细胞加入到96孔板中,①GFP组:MOI=40时转染了绿色荧光蛋白(GFP)重组病毒的细胞;②VEGF-165组:MOI=40时转染了单个目的基因的细胞(Lv-VEGF165);③BMP-2组:MOI=40时转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP2);④BMP-2/VEGF-165联合转染组:MOI=40时,通过联合基因转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP2-VEGF165),以未转染组作为此次实验的空白对照组,并加入5mg/L聚凝胺以增强感染。

1.4.4转染后引物的设计及BMP-2、VEGF-165mRNA的检测

应用Oligo6设计定量检测引物(表1),采用碘化钠法进行RNA的提取,采用M-MLV试剂盒进行cDNA的合成,用RT-PCR测定转染后7d的细胞内BMP-2和VEGF-165mRNA的相对表达量,及转染后1、2、4周的各组中骨钙素(OCN)的mRNA的相对表达量。

1.4.5转染后ELISA法检测各组BMP-2、VEGF-165、OCN蛋白的表达

取各组细胞上清液,其中,在3、7、14、21d检测BMP-2、VEGF-165相对蛋白的表达,1、2、4周检测OCN相对蛋白的表达,准备好操作试剂、预实验确定上清液的浓度,操作按照试剂盒的操作步骤进行检测时需要将培养液24h更换1次。

表1RT-PCR检测GAP、BMP-2、VEGF-165、OCN引物序列

1.4.6转染后碱性磷酸酶的测定及细胞生长活性的检测和生长曲线的绘制

在细胞转染后的第14天,按照碱性磷酸酶染色试剂盒(改良Gomori钙钴法)和检测试剂盒说明书步骤操作,MTT法检测转染后细胞生长活性,方法同转染前。

1.5统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行统计学处理经方差分析后,采用SNK(法对4组均数之间进行两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1倒置相差显微镜下观察细胞(图2)8h贴壁生长,24h后显微镜下可见密度高、圆形、大小不一的混杂细胞,72h后细胞的数量和贴壁面积增加明显,此时镜下可见大部分细胞呈长梭形,数量不等,细胞核不清晰,细胞质颗粒较多,贴壁细胞呈平行排列,簇状生长,有的呈漩涡状、网状、辐射状,有的细胞可见双核,周围胞质染色明显,2周左右可见细胞生长迅速,铺满培养基达90%。

图2第14天BMSCs细胞形态(×5)

2.2将第3代细胞诱导至7d时,BMSCs钙结节染色,效果不明显,当21d时出现明显的钙结节(图3)。

图3第21天BMSCs茜素红染色钙结节形态(×10)

2.3MTT法检测转染前后的细胞活性第1代细胞生长周期为潜伏期、对数生长期、平台期。第3代细胞转染后Lv-BMP2-VEGF165组BMSCs增殖稍快于Lv-BMP-2组、Lv-VEGF组,后两者增殖速度无明显差异且均快于空载组和未转染组(图4)。未转染组和空载组细胞生长曲线大体一致,此结果提示联合基因慢病毒转染方法未对细胞造成损伤。

图4各组BMSCs增殖活性

2.4转染后的第7天,RT-PCR检测结果(表2)BMP-2mRNA和VEGF-165mRNA在Lv-BMP2-VEGF165转染组共表达,其中BMP-2mRNA与BMP-2组的表达无明显差异(P>0.05),VEGF-165mRNA与VEGF-165组的表达无明显差异(P>0.05);对照组及GFP组、BMP-2组无VEGF-165mRNA的表达,对照组及GFP组、VEGF-165组无BMP-2mRNA的表达;Lv-BMP-2-VEGF-165转染组mRNA的表达高于单基因转染组(P<0.05),其中单基因转染组互相比较结果:BMP2组明显高于VEGF165组、GFP组、未转染组(P<0.01);VEGF-165组明显高于GFP组和未转染组(P<0.05)。

表2RT-PCR检测转染后7d各组样品BMP-2mRNA和VEGF-165mRNA相对表达

2.5ELISA法检测蛋白表达结果显示,BMP-2和VEGF-165蛋白只有在Lv-BMP2-VEGF165组中高表达(表3、表4),在BMP-2组和VEGF-165组中对应的BMP-2和VEGF-蛋白的表达均无统计学意义(P>0.05);对照组、GFP组无VEGF-165蛋白和BMP-2蛋白的表达,BMP-2组无VEGF-165蛋白的表达;VEGF-165组无BMP-2蛋白的表达。结果显示:Lv-BMP2-VEGF165组OCN蛋白的表达(表5、表6)显著高于其他各组(P<0.01),BMP-2组显著高于对照组、GFP组、VEGF-165组(P<0.01),VEGF-165组显著高于GFP组(P<0.05)。

表3不同组别第3、7、14、21天ELISA检测BMP-2蛋白表达

表4不同组别第3、7、14、21天ELISA检测VEGF-165蛋白表达

P值<0.001      <0.001      <0.001      <0.001

2.6转染后第14天检测碱性磷酸酶的活性联合转染组最高(136.0±18.0)未转染组最低(15.0±5.0),Lv-BMP2-VEGF165组ALP染色后可见细胞胞浆内大部分密集的黑色沙粒样颗粒,细胞核周围尤重,与细胞核的浅染色形成鲜明对比,细胞整体染色率可达90%,与倒置相差显微镜下观察到的胞核周围深色颗粒相符,说明这些质密的颗粒含有大量碱性磷酸酶,且BMP-2组、VEGF-165组细胞染色形态与双基因转染组相似,但整体胞浆深染率均低于双基因转染组,分别达80%、60%。未转染组和GFP组深染率仅5%。

表5RT-PCR检测转染后1、2、4周各组样品OCNmRNA表达

表6ELISA检测传染后1、2、4周各组样品OCN蛋白表达

3、讨论

BMSCs具有多向分化潜能,通过微环境的精修调节从而重建软骨或骨组织[5]。在诸多影响因子中,如肿瘤坏死因子等炎症因子,BMP-2、VEGF等细胞因子亦是近年的研究热点[6,7,8]。本实验采集山羊髂前上棘处骨髓液,全骨髓贴壁法体外增殖培养BMSCs,细胞呈现漩涡状、网状、辐射状,并在72h后进入对数生长期,5～6d即可传代。

慢病毒载体作为运载工具,通过插入目的基因导入宿主细胞内,能在宿主细胞内有效复制和表达。慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒(HIV-1)为基础发展而来的基因治疗载体,作为逆转录病毒科的一种二倍体病毒,起初是以其显性或隐性感染后,潜伏期长、发病缓慢为特点被学者所研究[9]。通过脂质体和线性聚乙烯亚胺(linearpolyethylenimine,LPEI)对慢病毒进行包装,高效低成本的转染试剂进行辅助,可以解决临床实验过程中对悬浮细胞感染效率低等问题[5,6]。本实验以慢病毒为载体将目的基因转染到山羊BMSCs中,通过MTT法检测:未转染组与空载组的细胞增长曲线无明显差异,RT-PCR结果显示:联合基因转染组的BMP-2、VEGF-165mRNA与蛋白的相对表达较单基因转染组高。ELISA结果显示,BMP-2和VEGF-165蛋白在Lv-BMP2-VEGF165组中高效表达,说明慢病毒载体不仅不会导致细胞的衰老、死亡,还能持续稳定表达目的基因,这对口腔颌面部骨组织缺损、颞下颌关节盘软骨组织的修复有积极意义。

BMP已被确定可促进骨组织的形成[7,10]。其机制是通过激活Smads信号通路的传导、调节成骨相关基因的转录而发挥成骨作用[10]。研究表明,在外伤情况下,低浓度的BMP-2对成骨无明显促成骨作用,一般1.5g/L高浓度的BMP-2方可单独诱导成骨[11]。通过转染BMP-2的方式植入BMSCs中,较单独通过化学方式诱导成骨更有效。VEGF是一种作用于血管内皮细胞的、具有肝素结合性的二聚体糖蛋白,同时具有增加血管通透性、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用[12,13]。软骨组织的发育、愈合与改建需要血管内营养物质的供应,血管的形成与早期骨的形成密切相关。而颞下颌关节是一个缺少血管、神经支配的密闭组织,VEGF-165的导入无疑给骨组织缺损处的愈合带来积极的临床效应。本次实验将VEGF-165和BMP-2同时导入目的细胞中,发现联合基因转染组中相应蛋白及mRNA的表达均高于单基因转染组。说明VEGF-165与BMP-2在现代组织工程的构建中具有级联放大效应。VEGF蛋白的半衰期较短,直接通过体外移植到相应的骨组织缺损处并发挥血管化的作用有一定的难度[14]。现大量实验证实,将VEGF-165转染BMSCs中,可直接作用于骨组织中的血管内皮细胞,促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管的形成,使骨缺损的部位重新充满新的血管,供应骨组织的生成,提供养分,在一定程度上促进了BMSCs向成骨细胞方向分化。

成骨细胞的生长包括细胞分化增殖、基质形成、基质钙化3个阶段。培养细胞14～21d时细胞外钙结节数量明显增加,茜素红可以识别细胞基质中是否有钙离子,从而确定成骨分化作为骨组织转换标记物;ALP和OCN亦可检测骨组织的形成和改建,从而指导临床治疗。有研究表明,在骨折愈合过程中,ALP会出现病理性升高,其作用机制是钙离子在ALP作用下沉积在胶原上,完成基质矿化的过程,故ALP可以反映骨组织中分解代谢水平,促进骨缺损的钙化及愈合。在初期形成钙化组织时活力较高,骨成熟后活力最低,在一定程度上反映了BMSCs的分化程度及相应基因转染后的功能状态[15]。已有研究表明ALP可反映早期成骨到骨组织成熟的状态,而OCN即可反映晚期成骨的状态[16],本实验结果明确转染后的组别中骨转换标记物的含量增加,从7、14、21d检测数据得出,联合基因转染组的OCN含量逐渐升高,在第14天达到峰值;而在第14天也是ALP活性最高的时间,故在转染后的第14天两种骨转换标记物指标的高峰无明显差异。

本实验证实了通过慢病毒转染后的双基因表达BMSCs较单独转染了BMP-2的BMSCs具有较高的成骨分化潜能,转染后的细胞均可以高效表达目的蛋白及ALP。BMP-2与VEGF-165对骨组织的形成及后期的塑造起协同作用,同时降低单独诱导的浓度,避免异位骨化及骨肿瘤的发生。

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基金:新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2016D01C249).