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光遗传学技术在神经时代中的变革研究

2020-08-15 268 上传者：管理员

摘要：光遗传学技术是将光学技术和遗传学结合的一种变革性研究方法，其独特的双向控制具有较高的空间和时间分辨率。该技术通过特定光刺激光敏感蛋白在短时间内激活或沉默特定细胞和神经回路，研究大脑功能异常的机制，并确定行为障碍的病因，为神经疾病的研究提供了理论指导，被认为是神经科学研究的理想工具。现总结了目前光遗传学技术在阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、癫痫等神经性疾病中的研究价值，以及在相关研究中的优点和尚未解决的问题，最终帮助研究者探究发病机制并寻找高效治疗策略。

关键词：
光感受器
光遗传学技术
神经元
神经性疾病
遗传
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2005年，研究者发现光敏蛋白能够使细胞膜去极化，让一类细胞变得光敏易控制，从此开拓了光遗传学的领域[1]。2007年以后，研究不再局限于无脊椎动物的小型实验中，随着探针和遗传编码工具不断进步，光学和遗传学技术结合的更加完善，光发生工具将可见光通过神经接口传递深入大脑内部，证明目标细胞与大脑行为的联系，在神经系统疾病中应用光遗传学技术可促进神经元修复和周围神经生长[2]。该技术发展迅速，增加了我们对综合性生理学的理解，开启了神经环路与相关行为的研究大门。光遗传学技术并不是孤立存在的，还要结合电生理学、药理学、影像学等方法获得生物行为反馈，在不同领域中理解大脑的功能，也成为了科学界研究神经回路基础的重要技术。

1、光遗传学技术介绍

光遗传学技术原理是利用某种工具载体，把光感基因转入至目的细胞当中，在一定波长的刺激下对离子产生选择性刺激，通过特殊离子通道表达，导致膜电位发生去极化或超级化，以达到对细胞兴奋或者抑制的目的。由此可见它有两个关键技术，第一是基因操控技术，主要是将目的基因进行更改与重组，光敏蛋白介入后整合在神经细胞上，模拟生理异常机制。第二个核心技术是光敏蛋白的选择，它可以控制离子跨越膜的数量，改变静息电位引起动作电位。

光发生工具为光遗传学发展提供了更大的可能性，是光遗传学发展中的关键部分。首先，光遗传学通过刺激视蛋白来改变细胞的活性。视蛋白可分为两类：(1)单成分视蛋白也称Ⅰ型光敏蛋白或微生物视蛋白，它的光感受器和离子电导由同一分子完成，又分为细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,BR)、嗜盐菌视紫红质(halorhodopsin,HR)、通道视紫红质(channelrhodopsin,ChR)，它们分别存在于原核生物、藻类和真菌中[3]，此外，根据作用效应单成分视蛋白也可分为去极化微生物视蛋白(ChR)和超级化微生物视蛋白(BR和HR);(2)多成分视蛋白也称Ⅱ型光敏蛋白或动物视蛋白，以共价键连接视黄醛来吸收光子而被调节，存在于高等真核生物中。Ⅰ型光敏蛋白是调节细胞活动的主要工具，Ⅱ型光敏蛋白是调控神经元兴奋性的光发生工具[4]。光敏蛋白在特定波段光的作用下，通过结构的改变导致神经元膜电位的改变，例如视蛋白植入目的细胞后，在蓝光的照射下其阳离子通道开放，使钠离子内流、钾离子外流，膜电位发生去极化使神经元兴奋。不同的视蛋白可以在同一个细胞中共同表达，增强或减弱细胞的活动。由于不同波段的光刺激在组织中的穿透强度不同，高强度的光才能满足光发生刺激的要求。其次，在细胞基因组中通过调控基因的转录来影响视蛋白的表达，病毒转导法有效且应用最广泛，被认为是未来临床应用的一种潜在途径。最后，它可以使光敏蛋白激活，实现体内照射研究。

该技术研究发展迅速可覆盖多种动物种系及神经科学领域，能用于诱导蛋白质之间相互作用，操纵酶活性[5]，调节单细胞和多细胞的生物基因转录，诱导自主活动的神经元，干细胞的细胞内氧化还原平衡[6]、胚胎发生过程中的信号通路机制[7]、调节神经元活性等不同生物医学的相关研究[8]，为建立大脑活动和行为的因果关系提供了一种非常重要的方法。

2、光遗传学技术在神经疾病中的应用

光遗传学技术在神经疾病中的应用迅速发展，以非侵入性方法精准探究神经回路、分子病理学和大脑免疫系统之间的作用潜力。它能够突破传统方法，允许光基因控制大脑任何区域，在空间和时间上精确控制神经回路，经过可控的演示测试相关行为，通过数据来评估细胞活动对生物体的行为影响，应用于神经疾病治疗是很有前景的，为研究组织中的神经发育和神经退行性疾病提供了新的方向[9]。

2.1 阿尔兹海默病

阿尔兹海默病(Alzheimer’sdisease,AD)患者数量占痴呆疾病的一半以上，因为起病隐匿常被人们所忽略，这种持续进行性发展的疾病会严重损害人的认知功能。它的危险因素包括年龄、性别、受教育程度等。β淀粉样蛋白聚集主要沉积在皮质区域，是AD大脑的标志性病变[10],Yamamoto[11]等采用SSFO(specializedstep-functionopsin)作为光敏蛋白，利用慢性光激活转基因小鼠体内突触前投射区的特定神经束，增强β淀粉样蛋白堆积，建立更完善的AD生物疾病模型，证明神经回路的损伤可能是AD发病的基础，但目前药物并不能有效治疗AD，对抗该疾病的手段仍然是以预防为主。海马的gamma神经振荡(30～100赫兹)是一种脑内神经元同步化的活动，与神经系统疾病关系密切[12]。AD发病的同时gamma慢振荡活动也变得异常，研究者发现恢复正常的慢振荡后，AD模型的淀粉样斑块沉淀反应逐渐停止，也有效防止了钙堆积对疾病的恶化影响[13]，证明了慢振荡在记忆中的作用，通过周期性的光生刺激将有助于逆转记忆的丢失[14]。非侵入性的内源性清除β淀粉样蛋白技术可作为一个潜在的治疗策略和进一步转化的研究基础。小胶质细胞是大脑主要的免疫细胞，功能类似于巨噬细胞，它对β淀粉样蛋白的作用是研究阿尔兹海默病中的热门方向，但由于缺乏非侵入的方法来操控细胞，传统研究受到了限制。光遗传学技术克服了这方面的不足，使用非侵入性40赫兹的白光刺激神经元，可观察到神经发生保护反应，促进小胶质细胞进入吞噬状态而不引起神经损伤，招募小胶质细胞使β淀粉样蛋白降低，影响了神经元和胶质细胞相互作用，进一步揭示了特定的gamma振荡在胶质细胞作用下能抑制AD的发展[15]。AD的记忆减退及认知功能丧失也是重要的发病症状之一，有研究发现，其原因更有可能是大脑的基因编码与信息整合过程的连接中断，而不是大脑储存信息的细胞受损[16]。

2.2 帕金森病

帕金森病(Parkinson’disease,PD)是一种老年人常见的神经退行性疾病，主要病变在黑质和纹状体，可伴有静止性震颤，肌张力增高和运动障碍等。该疾病一般由多种因素参与，比如年龄老化、遗传因素、环境毒物、感染、氧化应激及自由基形成等等，目前所有药物治疗只能改善患者症状，而不能阻止疾病发展。Girasole等[17]研究了左旋多巴引起运动障碍的神经群，将活性神经元靶向重组，建立纹状体活动和运动障碍之间的直接联系，在没有左旋多巴的情况下，再活化的网状纹状体神经元也会产生运动障碍，为预防和管理左旋多巴引起的运动障碍提供证据，进一步阐明了能够抑制PD发展的因素。多巴胺减少的小鼠在光发生刺激下增加纹状体的多巴胺水平，确定了基底神经节投射的神经元亚群能够控制运动其行为[18]。Steinbeck等[19]实时调节来自人类胚胎干细胞的中脑多巴胺神经元，结合电生理学和药理学等方法，探究了移植的神经细胞的功能机制。在动物模型中，移植人类干细胞衍生的神经细胞也同样可以恢复PD的行为[20]。虽然大部分PD治疗以大脑深部作为靶点，但是皮层刺激也可以改善PD症状。大脑深部的电刺激不仅会影响丘脑底核的神经元和强直通道长神经纤维，还会影响遍布大脑的不同类型的支持细胞等，这表明刺激大脑运动皮层可以逆转PD运动障碍，是当前缓解PD症状的外科手术方法之一[21]。光发生引起深部刺激使神经元的活动模式发生了巨大转变，结合药物治疗有助于改善PD的认知障碍[22]。这些研究可直接有效的定位PD病变的部位，寻找治疗靶点。

2.3 亨廷顿舞蹈症

亨廷顿舞蹈症(Huntington’disease,HD)是一种常染色体显性遗传的神经性疾病，CAG三联密码子的重复次数出现异常增加，会发生不受控制的自主运动，与纹状体通路输出关系密切[23]，影响神经功能失调并伴有认知能力进行性下降。Cepeda等[24]发现刺激小鼠模型神经元能使γ-氨基丁酸(GABA)突触活性增加。GABA神经元激活过度会导致HD神经系统不良反应以及脑损伤积累加重。Perez-Rosello等[25]采用电生理学和光发生学方法，从小鼠离体大脑切片上研究了纹状体突触传递，发现HD小鼠模型中，这一变化与突触前膜GABA释放的数量增加联系并不明显，而与GABA释放后的突触部位反应增强有关，快速的激活或抑制可为急性纠正神经元的异常活动提供治疗干预手段。利用光遗传学技术抑制纹状体GABA神经元活动，可上调内皮细胞对碱性成纤维细胞生长因子的表达，减少脑萎缩量，促使神经细胞活动趋于正常，HD相关的异常活动恢复正常[26]。

2.4 癫痫

癫痫(Epilepsy)是一种慢性的神经系统脑部疾病，我国每年新发癫痫患者逐年增加，其中儿童占比最多，它是以脑内局部病灶神经元高度同步化放电为特征的临床综合征[27]。如果一位严重的癫痫患者大脑颞叶区域活动被抑制，同时也会丧失其学习新知识的能力，这使颞叶癫痫的药物治疗手段变得非常棘手。光遗传学技术可用于了解颞叶癫痫的脑部发生机制，让研究者有针对性的抑制浦肯野细胞的兴奋[28]。脑部的活动从平静状态变为极度活跃状态时胶质细胞也发挥重要作用，光遗传学介入的神经胶质细胞被激活后，神经胶质群被广泛同步性激活，在癫痫发作前产生胶质，通过谷氨酸和缝隙连接作用刺激附近神经元，证明神经胶质与神经元的相互作用是广泛性癫痫状态转变的基础[29]。GABA神经活动被认为是引发癫痫发作的重要机制，WangY等[30]将光遗传技术与化学遗传技术结合，发现颞叶癫痫患者的继发全身性癫痫发作现象与GABA神经微环路关系密切。研究表明，光刺激谷氨酸能神经元只会在GABA完整传递的情况下触发癫痫发作[31]，对中间神经元或相关细胞的低频刺激可以消除癫痫发作[32]。进一步研究发现，选择性地刺激中缝核背侧5-羟色胺神经元，可抑制癫痫引起的呼吸骤停，并产生抗惊厥作用[33]。进一步结合了转换纳米颗粒后，光纤能够有效的延长刺激，到达的大脑深部进行光的远程递送。模型小鼠的海马区被纳米颗粒注射后，再用近红外光照射头盖骨表面，癫痫神经元被有效抑制[34]。这种技术可逐步实现非侵入性治疗，不仅稳定并且有生物相容性，为精准治疗癫痫的提供了有力的实验方法。

2.5 多发性硬化症

多发性硬化症(Multiplesclerosis)是一种侵犯神经纤维髓鞘的疾病，与基因、环境和免疫功能异常等有关。神经肌肉回路(neuromusclecircuits,NMCs)对自主运动至关重要，有效的NMCs模型可以了解硬化症在内的多种疾病的发病机制，光遗传学可证实功能性神经细胞的在其模型中的形成[35]。少突胶质细胞功能障碍和凋亡是导致该疾病发生发展的重要因素，利用光遗传学技术刺激小鼠运动皮层的神经元，使少突胶质细胞增殖、轴突髓鞘形成和神经元活动增加，这些可塑性调节能够用于疾病的干预[36]，改善小鼠运动功能。通过改造单细胞生物膜上的质子泵，在日光下使其质子移到胞外产生膜电位，得到输入电信号、输出光信号的蛋白作为荧光探针，同时加入一种光敏感的通道蛋白产生动作电位。结合光遗传学、钙成像和微流体学装置还可用来测量不同神经元群体之间的连接程度和突触活动状态。利用这种手段可以激活并观察多个神经元[37]，产生动作电位[38]，并作为新的离子通道调控物质的筛选平台。目前，已成功利用该荧光探针检测了膜电位变化[39]，该研究有助于人们对神经细胞膜电位相关疾病药物的开发和研究，在大规模研究突触的可塑性、大脑记忆及在神经纤维疾病中膜电位调节起到重要作用[40]。

3、讨论

从光遗传学技术诞生不久起，科学界对光遗传学应用于临床的探索就没有停止过，它的优点有很多。(1)精准性及特异性。只兴奋或抑制已被转染的轴突，未被转染的细胞不会受到影响，将单个神经元的功能分离出来进行选择性的被调节，与其控制的行为联系到一起，方便探究神经元的功能和连接，改善传统手段对机体的调节波及范围大的缺点。(2)速度优势。光就像操纵的开关，光敏蛋白对特定波长反应迅速而精准，可能只需要几毫秒，去除光刺激的蛋白恢复到原来构象的时间可能从几秒钟到几小时不等[41]，这让刺激的传递更加简单、快速且无创，实现对神经元的双向调节。(3)非侵入性。传统光传输系统中有复杂的传输装置，限制了实验中动物的活动和自然行为。光发生工具的迅速发展突破物理限制，通过天线设计无线刺激微型电路提高应用性和重复性，损害更小、安装更容易、重量更轻，极大地提升光遗传学技术的应用空间[42]。(4)用于治疗神经疾病，减少了药物成瘾或耐药机制的发生。(5)光遗传学不仅作为一种研究工具，未来可能会发展成为人类神经退行性疾病和情感疾病诊断的工具。

尽管光遗传学技术有很大的发展潜力，但也面临着更多的挑战。(1)能量沉积。单一特定类型细胞机制应用在整个机体活动中，可能会出现额外的复杂性，靶向细胞是否会产生能量累积和发热效应，是否会引起非生理性的神经递质释放等。(2)光遗传学工具。在从原核生物和低等真核生物扩展到哺乳动物模型实验中，光遗传学系统工具的发展至关重要，我们还需要确定更多数量的独立可用的刺激通道。(3)功能输出。不同生物及不同细胞类型的信号在功能输出上存在差异，外源性刺激是否会给机体产生非自然作用尚未明确，基因在长期表达的情况下可能存在副作用的风险。(4)应用范围。目前该技术还不成熟，是否能扩展到所有想要的区域有待探索，对于现有实验结果还需要更充分的验证，非特异性的表达能否在各个领域的研究进行转换。(5)安全性。长期实验的安全性还需进一步评估。从动物实验到临床应用，从精准调节靶细胞到帮助机体恢复健康还有很长的路要走。

4、总结与展望

综上所述，光遗传学在神经系统疾病治疗中具有重要作用，它的发明和应用改变了我们对基因表达和蛋白调控的看法，尽管神经退行性疾病相关的机制尚未完全明确，但在寻找神经疾病的潜在靶点和药物开发上具有不可替代的作用。该技术还可用于在药物成瘾、创伤后应激障碍、自闭症、精神分裂、精神睡眠障碍、双向情感障碍、慢性疼痛、脑胶质等疾病的治疗中，为人类与疾病的对抗带来了新的曙光。

谭晶,栾海艳,孙跞,李思博,辛华.神经时代中的光遗传学技术[J].广东化工,2020,47(14):97-99.