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胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中CHD5的功能研究分析

2020-08-15 205 上传者：管理员

摘要：CHD5蛋白是一种ATP依赖性染色质重塑解旋酶,属于CHD家族.CHD家族成员在胚胎发育及肿瘤发生发展过程中具有重要的作用.前期研究发现CHD5在多种不同类型的肿瘤中发挥抑癌功能,但不清楚CHD5是否影响早期胚胎干细胞分化.本研究发现随着胚胎干细胞向神经前体细胞的分化,CHD5的表达显著上调.干扰CHD5的表达之后对细胞进行向神经前体细胞分化的诱导,发现POU5F1和NANOG等胚胎干细胞标志基因表达上调,Wnt信号通路激活,而PAX6和SOX1等神经前体细胞的标志基因表达得以抑制,表明CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中具有重要功能.

关键词：
CHD5
分化
神经前体细胞
细胞
胚胎干细胞
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胚胎干细胞的自我更新和分化是一个复杂的体系,当细胞生长的平衡被打破,细胞自身的稳态也被破坏,胚胎干细胞将启动自身的多向分化程序[1].影响胚胎干细胞稳态的因素主要包括转录因子的调控(如Oct-4和Nanog等的调控功能)[2],WNT、BMP、Activin/Nadol等信号通路对胚胎干细胞多向分化的调控作用,染色质重塑等表观遗传学修饰等.染色质重塑复合物主要包括SWI/SNF(Switch/sucrosenonfermentable)复合物,ISWI复合物和NuRD(nucleosomeremodelingandhistonedeacetylation)复合物[3,4,5].

CHD家族是一类染色质重塑蛋白,目前共有9个成员,都具有解旋酶结构域和染色质域(chromodomain).CHD家族成员以各自特有的方式与DNA结合,或者与组蛋白相互作用来参与染色质的重塑[6].目前研究结果表明大多成员在胚胎发育及肿瘤发生发展过程中具有重要作用.CHD1和CHD2在结构上相近,被归为一类.利用RNAi技术干扰小鼠胚胎干细胞中Chd1的表达,将导致小鼠胚胎干细胞多能性的丧失Chd1主要通过维持染色质的常染色质化,保持染色质的开放性,使小鼠胚胎干细胞维持干性[4].Chd2基因缺失的小鼠会出现胚胎发育迟钝,且在出生前死亡[7].Chd3和Chd4除具有典型的ATPase结构域和染色质域之外,还具有两个PHD锌指结构域.CHD3和CHD4是NuRD复合物的组成成分,条件敲除小鼠造血细胞中的Chd4基因,将导致造血干细胞的平衡体系紊乱,无法分化为淋巴系细胞,胸腺T细胞的发育也受到影响[8].CHD7为嗅觉干细胞增殖和分化所必需[9].CHD5突变或缺失会导致p53表达异常致使人类多种癌症的发生,包括上皮组织相关的乳腺癌,肠癌,甲状腺癌等;神经组织相关的黑色素瘤,神经胶质母细胞瘤等;造血细胞来源的急性髓系白血病,慢性髓系白血病等[10,11].在正常的细胞中,机体内部通过适当的调控p19来调控p53发挥其正常的肿瘤抑制功能,在CHD5拷贝数增加的细胞中,p19的表达量上调,进而上调p53的表达.特异性干扰CHD5表达后p19和p53的表达下调,p53的表达下调使得细胞内的肿瘤抑制机制减弱,使细胞发生癌变[12].并且p53能抑制NANOG的表达,使胚胎干细胞趋向于分化[13].

本研究发现,随着胚胎干细胞向神经前体细胞的诱导分化,CHD5的表达显著上调.干扰CHD5的表达之后对细胞进行向神经前体细胞分化的诱导,发现胚胎干细胞多潜能性标志基因的下调表达逆转,Wnt信号通路的激活,而神经前体细胞的标志基因表达受到了抑制.

1、材料与方法

1.1 材料

H1hESC来源于WiCellResearchInstitute.Anti-Oct(3/4)、Anti-CHD5、Anti-p-smad1/5/8、AntiSmad1/5/8等购自Santa;Anti-PAX6购自Covnce;Anti-SOX2、Anti-SOX1、Anti-NANOG、Anti-NES-TIN等购自CST.

1.2 细胞培养

H1hESC来源于WiCellResearchInstitute.利用stemcell公司的mTeSR培养基在37℃培养箱常规培养.每天换液,每隔3-4d进行传代.dispase消化5-8min,按1∶4的比例进行传代培养.

1.3 细胞感染

取可传代的细胞(6孔板一孔),消化,清洗,离心,用新鲜的mTeSR培养基(含3μg/mLpolybrene)重悬细胞,加入浓缩过的病毒,轻轻吹打离心管底部,移至用matrigel包被过的6孔板中.摇晃均匀,放置37℃培养

1.4 神经分化诱导模型

用mTeSR培养至细胞长满培养皿底部,换含有CompoundC(终浓度为200μmol/L)的诱导分化培养基,每天换液.

1.5 实时定量PCR检测基因表达

取诱导分化不同时间点的细胞进行RNA的提取与反转录,按照SYBRPremixExTaqII(宝生物染料法荧光定量试剂盒)说明进行操作,于Eppendorf公司荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR检测目的基因的表达.所用引物详细名称和序列见表1.

表1实时荧光定量聚合酶链式反应相关基因特异性引物序列

1.6 蛋白质免疫印迹

收集的细胞蛋白样经SDS-PAGE电泳后,转印至硝酸纤维素膜经丽春红预染液蛋白预染;TBST洗涤后行5%脱脂牛奶(PBS+0.1%TWEEN20)室温封闭1-2h;一抗室温孵育3h或4℃孵育过夜;PBST清洗3次,每次5min;结合二抗,室温孵育2h;PBST清洗3次,每次10min;最后用ECL显色,X-胶片感光,经显影、定影之后晾干.

2、结果与分析

2.1 CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中表达显著上调

应用含有CompoundC(终浓度为200μmol/L)的诱导分化培养基处理单层培养的胚胎干细胞,在第0、1、2、3、4和第5d收集细胞提取总RNA反转录,定量PCR结果显示随着诱导分化时间的延长,胚胎干细胞多能性的标志基因POU5F1和NANOG的表达逐渐下调(图1A),而神经前体细胞的标志基因PAX6,SOX1等表达逐渐上升(图1B),表明胚胎干细胞已经逐步分化为神经前体细胞.在诱导分化模型的动态变化过程中,CHD家族的9个成员中,只有CHD5的mRNA的表达有4-5倍的上调,其它成员的表达无明显变化(图1C).蛋白表达水平的检测结果表明多能性标志因子OCT4,NANOG的表达随着神经分化诱导逐渐丧失,神经前体细胞的标志基因SOX1,PAX6等蛋白表达逐渐上调.CHD5的蛋白表达也呈现为明显的上调(图1D).这些结果表明在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中,CHD5表达显著上调.

图1CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中表达显著上调

A:胚胎干细胞标志基因转录水平表达；B:神经前体细胞标志基因转录水平表达；C:CHD家族基因转录水平表达；D:神经分化诱导过程中CHD5等蛋白表达水平

2.2 干扰CHD5的表达可以抑制胚胎干细胞向神经前体细胞的分化

为了干扰CHD5的表达,从sigma公司购买了5条针对CHD5的shRNA,编号分别为sh1079,sh1886,sh2308,sh3931,sh5443.将这5条shRNA质粒进行病毒包装,感染胚胎干细胞.结果表明sh3931和sh5443的干扰效率比较高(图2A).应用sh3931,sh5443病毒感染胚胎干细胞后,神经分化诱导5d后收集细胞样品检测基因的表达.结果表明在CHD5敲减的条件下,多能性标志基因蛋白表达的下调得到部分逆转(图2B).为了进一步研究CHD5的功能,筛选出4株稳定干扰CHD5表达的细胞株(1#,2#,3#,4#),进行神经诱导分化,蛋白表达检测结果表明多能性标志基因的丧失得到很大程度的逆转,神经前体细胞标志基因上调的趋势受到抑制,在得到的细胞株中检测p53的表达,也有明显的下调(图2C).这些结果表明CHD5参与了胚胎干细胞向神经前体细胞的分化的调控网络.

图2干扰CHD5的表达可以抑制胚胎干细胞向神经前体细胞的分化

A:筛选能有效干扰CHD5表达的shRNA;B:病毒感染胚胎干细胞后行神经分化诱导并检测相关标志分子的表达;C:筛选稳定干扰CHD5的细胞克隆后行神经分化诱导并检测相关标志分子的表达

2.3 CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中的表达抑制不影响其家族成员的表达

在稳定干扰CHD5表达的细胞株中行神经分化诱导,定量PCR技术检测CHD家族其他成员的表达,结果表明,在CHD5的表达敲减时,其家族成员的表达并无显著变化(图3).虽然有文献报道CHD家族的多个成员参与胚胎干细胞分化的进程,但在胚胎干细胞向神经前体分化的过程中可能只有CHD5发挥重要作用.

图3CHD5的表达变化不影响CHD家族其他基因的表达

2.4 CHD5的表达抑制Wnt信号通路的活性

为了进一步分析CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中的作用机制,在干扰CHD5表达的细胞株中,检测BMP信号通路关键分子磷酸化和非磷酸化smad1/5/8,Activin信号通路关键分子Smad2/3和Wnt信号通路中磷酸化和非磷酸化β-catenin的表达,结果发现CHD5的干扰仅抑制β-catenin的磷酸化,使β-catenin不能发生磷酸化降解,从而增强Wnt信号通路的活性(图4A).为进一步验证CHD5调控Wnt信号通路,在CHD5稳定干扰的细胞株中,分别转染Wnt信号通路报告基因的质粒和Activin信号通路报告基因的质粒.双报告基因检测结果为干扰CHD5表达之后Wnt信号通路的活性升高(图4B),而Activin信号通路无明显调控作用(图4C).

图4CHD5抑制Wnt信号通路的激活

A:检测胚胎干细胞分化相关调节信号通路的标志分子;B:报告基因系统检测Wnt信号通路激活;C:报告基因系统检测Activin信号通路

3、讨论

CHD5蛋白是一种ATP依赖性染色质重塑解旋酶,前期发表的结果指出CHD5抑制肿瘤细胞的增殖、转移和上皮-间质转化.目前普遍认为CHD5是一个在多种不同类型的肿瘤中发挥抑癌作用的染色质重塑解旋酶.CHD家族成员在胚胎发育及肿瘤发生发展过程中具有重要的作用,但不清楚CHD5在早期胚胎干细胞分化过程中的功能.

本研究利用小分子抑制剂CompoundC定向诱导人类胚胎干细胞向神经前体细胞分化,结果表明随着人类胚胎干细胞向神经前体细胞的分化,胚胎干细胞的多能性标志基因POU5F1和NANOG表达量逐渐下降,神经前体细胞的标志基因PAX6和SOX1等表达量逐渐上升,CHD5的表达也呈现明显的上升趋势,而CHD家族其他成员却没有明显的表达变化.利用慢病毒干扰CHD5的表达,CHD5在mRNA和蛋白水平表达明显下降,干扰CHD5的表达之后对细胞进行向神经前体细胞分化的诱导,检测到胚胎干细胞多潜能性标志基因POU5F1和NANOG表达水平的下降得到了逆转,而神经前体细胞的标志基因PAX6和SOX1上调受到抑制.信号通路的调节对于胚胎干细胞的分化具有十分重要的作用.主要包括WNT,BMP,Activin/Nadol等信号通路.CHD5干扰之后,Wnt信号通路的活性上升,其关键信号分子β-catenin的表达上升,而BMP和Activin/Nadol信号通路无显著变化,提示CHD5可能通过抑制Wnt信号通路来调节hESC向神经前体细胞的分化.到目前为止,对于CHD5与胚胎干细胞之间关系的了解知之甚少,仅一篇文章鉴定出CHD5在小鼠胚胎细胞中可以调控神经元相关基因的表达.人类胚胎干细胞发育为成熟的神经细胞,要经过神经诱导和神经发生两个阶段,本项研究说明CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞早期分化的神经诱导阶段具有重要的功能.

孙同花,田莎,高昂,孙家富,周家喜,朱正茂.CHD5在胚胎干细胞向神经前体细胞分化过程中的功能研究[J].南开大学学报(自然科学版),2020,53(03):43-48.

基金:国家自然科学基金(91649107);天津市自然科学基金(17JCYBJC24100).