蓝舌病（bluetongue,BT）是一种由蓝舌病病毒（bluetonguevirus,BTV）感染引起的烈性出血性动物疫病。BTV主要通过库蠓属（Culicoidesspp.）雌性昆虫的吸血叮咬传播，能够感染牛、羊、骆驼和鹿等多种家养及野生反刍动物[1]。BTV感染绵羊后可引起较高的发病率和病死率[2,3,4]。而牛和山羊感染BTV后往往无明显的临床症状，在BTV传播过程中扮演了病毒储存库角色[3,4]。据统计，BT对全球畜牧业生产每年造成约30亿美元的经济损失，因此被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[5,6]。

BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），其基因组由10条（genomicsegment1～10,Seg-1～10）双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA）片段组成，可编码7种结构蛋白（VP1～7）和5种非结构蛋白（NS1～4以及NS3a)[7]。Seg-2/VP2是BTV变异程度最高的成分。VP2能够诱导被感染动物产生特异性中和抗体，对病毒血清型（serotype）具有决定性作用[7,8]。2008年至今，世界范围新发现了4种BTV新血清型（BTV-25～28）。因此，BTV血清型由过去的24种增加至28种（BTV-1～28)[9,10,11,12]。

虽然VP3序列在BTV毒株间高度保守，但编码该蛋白的Seg-3序列随BTV毒株流行地域不同而出现差异，因此可以根据其序列差异，将世界范围内BTV毒株划分为东方（Eastern）和西方（Western）两种主要的地域型（topotype)[13,14]。与VP3类似，VP7和NS3蛋白的保守程度也较高，其编码节段Seg-7和Seg-10的序列变异也与BTV毒株流行地域密切相关，可根据Seg-7和Seg-10的序列差异，将世界范围内BTV毒株分为东方和西方两种主要的地域型以及数种地域亚型[13]。Seg-3、-7和-10序列具有强烈的地域特征，因此进行上述基因组节段序列分析，能够为追溯病毒起源提供依据[13,14,15]。

我国1979年首次在云南省师宗县绵羊中记录了BT的暴发[16]。之后，湖北省、安徽省、四川省和山西省相继暴发BT，并陆续分离到BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16型毒株，其中BTV-1和BTV-16型在我国流行广泛，并且都能够导致绵羊出现较明显的临床症状[17,18,19]。2012年以来，在国家公益性行业（农业）专项资助下，云南省畜牧兽医科学院在云南省、广西壮族自治区、广东省、湖北省、江苏省、山西省、新疆维吾尔自治区和内蒙古自治区等8个省份设立哨兵动物，共分离到12种血清型BTV毒株（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)[20,21,22,23]。

多种血清型BTV在我国广泛流行，不同血清型毒株间缺乏交叉保护，病毒通过突变和基因重配，不断产生变异毒株[17,20,22]，这些都为当前的BT防治工作带来了挑战。对我国不同历史时期的BTV流行毒株进行序列比较分析，有助于掌握BTV的演化特征以及我国BTV流行毒株的溯源分析。虽然本实验室已经完成了2012年以来我国不同血清型BTV分离毒株的全基因组测序，但对1995—1997年云南省BTV流行毒株的遗传特征尚不清楚。因此，对1995—1997年分离自云南省分属7种血清型的25株BTV毒株的Seg-2、-3、-7和-10基因节段进行了扩增、测序和遗传特征分析，以期为我国BTV的演化分析与溯源研究提供科学数据。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）和minimumEagle'smedium(MEM）培养基，购自ThermoScientific公司；一步法RT-PCR试剂盒HiScriptⅡOneStepRT-PCRKit(DyePlus），购自南京诺唯赞生物科技有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒和UniversalDNA胶回收纯化试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 细胞、毒株和病毒培养

幼仓鼠肾细胞（babyhamsterkidneycells,BHK-21），由本实验保存；25株BTV毒株，1995—1997年分离自云南省师宗、芒市、景洪、峨山等地设立的哨兵牛，病毒分离信息见表1。将分离的BTV毒株接种BHK-21细胞，当细胞病变（cytopathiceffect,CPE）达到90%时刮下细胞，4℃8000r/min离心15min，弃去沉淀，将病毒液分装，-80℃保存备用。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中公布的BTV毒株序列，采用Oligo7.0软件设计10对引物，分别用于扩增7种BTV血清型毒株的Seg-2、-3、-7和-10（表2）。引物委托上海捷瑞公司合成，以聚碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate,DEPC）处理水稀释至终浓度为10μmol/L备用。

表11995—1997年云南省BTV分离毒株信息

1.4 RT-PCR扩增与测序

采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒抽提病毒核酸，将核酸于94℃变性3min后，立即冰浴。分别取5μL变性核酸为模板，使用表2中的引物对，采用一步法RT-PCR，对BTV分离毒株的Seg-2、-3、-7和-10进行扩增。反应体系如下：2×OneStepMix(DyePlus)25μL,OneStepEnzymeMix2.5μL，上下游引物（10μmol/L）各2μL，核酸模板5μL，以无RNA酶水补足至50μL。反应条件如下：50℃30min,94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃1.5min,35个循环。利用UniversalDNA胶回收纯化试剂盒，对PCR产物进行电泳胶回收，以PCR扩增的上、下游引物作为测序引物，对纯化的DNA进行双向测序。

1.5 序列分析与系统发生树构建

使用DNAstar软件（Ver6.0），对测序结果进行序列拼接组装；利用MEGA6.0软件[24]，进行序列比对分析。采用最大似然法（maximumlikelihood,ML）构建系统发生树：Seg-2序列选择“GTR+G”模型，Seg-3序列选择“TN93+G+I”模型，Seg-7序列选择“GTR+G+I”模型，Seg-10序列选择“T92+G”模型，自举检验（bootstrap）取值1000。序列相似度，以平均数（mean）表示。本研究中获取的序列以黑色菱形符号表示。系统发生树中其他国家分离的BTV毒株序列以“GenBank序列号＿BTV血清型＿分离国家＿病毒分离时间”表示。

2、结果与分析

2.1 Seg-2、-3、-7和-10的RT-PCR扩增

表2云南省BTV分离毒株Seg-2、-3、-7和-10的RT-PCR扩增引物信息

设计10对引物（表2），对分离的25株BTV毒株Seg-2、-3、-7和-10进行一步法RT-PCR扩增。结果显示，7对针对不同血清型Seg-2的引物均能够特异性地扩增出大小约为1200bp，与预期大小相符的DNA片段，而针对Seg-3、-7和-10的3对引物，也能够特异性扩增出大小分别为1100、1100和800bp，与预期大小相符的目的DNA片段。

2.2 Seg-2序列分析

序列比对分析显示，云南省1995—1997年分离的25株BTV毒株分属BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16型等7种血清型。世界范围内27种血清型（BTV-1～27)BTV毒株的Seg-2可分为12种基因型（NucleotypeA—L)[13,15]。在系统发生树上，本研究中的25株BTVSeg-2与对应血清型BTV参考毒株聚为一簇，分属A、B、H、I、G和J等6种基因型，与对应血清型BTV国际标准参考毒株的Seg-2序列相似度大于68.10%,VP2序列相似度大于75.00%（图1～2），表明早期通过血清中和试验对BTV血清型鉴定结果的正确性。云南省分离的同一种血清型BTV的Seg-2/VP2序列高度相似，Seg-2核苷酸序列相似度在92.80%～100%之间，VP2氨基酸序列相似度在96.90%～100%之间（图2），表明云南省流行的同一血清型BTV的Seg-2有着最近的共有祖先。

研究发现，同种血清型BTV毒株Seg-2之间，其序列也存在较大差异，并可根据这种差异，将同一血清型BTV的Seg-2分为东方地域型（Easterntopotype）和西方地域型（Westerntopotype)[13,15]。构建的系统发生树显示，云南省分离的2株BTV-12型毒株（B139和B334）的Seg-2与南非BTV-12型毒株聚为一簇，序列相似度大于98.10%，属于Western地域型。云南省分离的BTV-1、-2、-3、-4、-15和-16型等毒株的Seg-2与分离自日本、印度和澳大利亚的同血清型毒株聚为Eastern地域型，其Seg-2序列相似度在89.03%～95.46%之间，VP2序列相似度在90.92%～98.30%之间；与同血清型Western地域型毒株的Seg-2序列相似度在68.00%～95.81%之间，VP2序列相似度在75.28%～97.14%之间（图1～2）。

2.3 Seg-3序列分析

Seg-3序列比对分析显示，本研究的25株BTV毒株间Seg-3核苷酸序列相似度在79.35%～93.93%之间，VP3氨基酸序列相似度在96.83%～99.95%之间（图2）。构建的Seg-3系统发生树显示，云南省分离的25株BTV毒株与来自中国台湾、澳大利亚和印度等地的毒株一同构成Eastern地域型（图3）。本研究中的25株BTV与国外分离的Eastern地域型、Western地域型和新血清型（BTV-25～28）毒株间Seg-3序列相似度在74.63%～89.29%之间，VP3序列相似度在88.69%～99.12%之间（图2）。在Eastern地域型内部，4株云南省分离的BTV-15型毒株与1株澳大利亚的BTV-15型毒株聚为相对独立的一簇，构成远东地域亚型（FarEasterntopotype）（图3)[15]，与Eastern地域型其他毒株以及Western地域型、新血清型（BTV-25～28）毒株间的Seg-3/VP3序列相似度在75.18%～79.60%/88.20%～96.83%之间（图2）。这一方面表明云南省与澳大利亚的BTV-15型毒株Seg-3有着共同的起源，另一方面也表明该基因节段在进化上的相对独立性。

2.4 Seg-7序列分析

云南省不同血清型BTV毒株间Seg-7核苷酸序列相似度在73.85%～94.36%之间，VP7氨基酸序列相似度在85.96%～99.35%之间（图2）。Maan等[13]的研究显示，BTV的Seg-7可分为3种东方地域亚型（Easterntopotype1～3）和7种西方地域亚型（Westerntopotype1～7）。云南省分离的21株BTV毒株的Seg-7分属Easterntopotype1～3地域亚型，分别与来自中国台湾、日本、印度和澳大利亚等地毒株的Seg-7享有最近的亲缘关系（图4）。值得注意的是，云南省4株BTV的Seg-7属于Western地域型：云南省BTV-2型毒株（B238）和BTV-12型毒株（B139和B334）的Seg-7属于Westerntopotype1地域亚型，与南非毒株具有最近的亲缘关系[13]，序列相似度大于98.60%;BTV-16型（B034）毒株为Westerntopotype3地域亚型，与荷兰毒株（GQ506478）和南非毒株（GQ506512）具有最近的亲缘关系，序列相似度均为95.60%（图4）。上述4株BTV毒株的Seg-7序列相似度在78.90%～100%之间，VP7序列相似度在94.60%～100%之间，而与云南省分离的Eastern地域型毒株的Seg-7/VP7序列相似度分别在78.33%～79.07%/94.46%～95.74%之间（图2）。

图11995—1997年云南省BTV分离毒株Seg-2系统发生树

◆为本研究中分离的BTV毒株；树图节点的数值表示重复1000次的自举检验可信值。

2.5 Seg-10序列分析

云南省分离的25株BTV毒株的Seg-10核苷酸序列相似度在86.61%～94.68%之间，NS3氨基酸序列相似度在95.00%～99.08%之间（图2）。BTV毒株Seg-10系统发生树显示，该基因节段序列被划分为2个东方地域亚型（Easterntopotype1～2）和3个西方地域亚型（Westerntopotype1～3）（图5)[13]。云南省分离的22株BTV毒株的Seg-10均属于Easterntopotype1地域亚型，分别与来自中国台湾、日本、印度和澳大利亚等地毒株的Seg-10享有最近的亲缘关系（图5）。而3株云南省分离的BTV-15型毒株（B105、B358和B359）单独构成Easterntopotype2地域亚型，与其他地域亚型毒株间Seg-10/NS3序列相似度则在76.93%～85.81%/83.41%～97.26%之间（图2、图5）。本研究中的25株BTV与Easterntopotype1地域亚型内其他毒株、Easterntopotype2地域亚型和Western地域型亚型毒株间的Seg-10序列相似度在77.02%～91.37%之间，NS3序列相似度在83.23%～97.55%之间（图2、图5）。

图21995—1997年云南省BTV分离毒株核苷酸/氨基酸序列相似度

Δ.核苷酸序列相似度；○.氨基酸序列相似度；―.序列相似度平均值。

3、讨论

云南省复杂的地理环境和气候条件造就了该地区动物、植物和病毒的天然多样性。云南省地处我国边境地区，与越南、老挝和缅甸等多国接壤，家畜及畜产品贸易频繁，动物疫病跨境传播风险较高。多种血清型BTV在云南省广泛流行，说明该地区在我国BT防控中具有举足轻重的地位。过去认为BTV主要流行于南纬35˚至北纬40˚之间。但是，随着气候变暖、库蠓活动范围扩大和潜在传播虫媒种类增多，BT有逐渐向寒冷的高海拔和高纬度地区扩散的趋势[2,25,26,27]，对我国北方地区的牛羊养殖业构成了威胁。掌握云南省1995—1997年BTV流行毒株的遗传背景，能够为分析我国BTV演化特征，进行病毒扩散与溯源分析提供宝贵的序列信息。

1995—1997年，本实验室在云南省分离出7种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15和-16),2012年至今，在云南省哨兵动物中分离出11种血清型BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-5、-9、-12、-15、-16、-21和-24)[17,18,19,20,21,22,23]，表明云南省流行的BTV血清型具有多样性。BTV-5、-9、-21和-24等4种血清型BTV在云南省的首次发现，提示我国可能还有其他血清型BTV存在，因此对我国流行BTV多样性的监测仍是一个长期的过程。病毒所处的生态环境不同，施加的选择压力不同，病毒的基因进化就会呈现出特定的地域特征。本研究发现，云南省流行的BTV毒株序列也呈现出特有的地域特征：云南省流行的BTV-15型毒株的Seg-3形成了独立于Eastern地域型和Western地域型的进化分支（FarEasterntopotype),BTV-1和BTV-16型毒株的Seg-2也形成了独立的进化支系，BTV-15型毒株的Seg-10形成独立的Easterntopotype2地域亚型，揭示了云南省流行的BTV在进化上的独特性。

图31995—1997年云南省BTV分离毒株Seg-3系统发生树

◆为本研究中分离的BTV毒株；树图节点的数值表示重复1000次的自举检验可信值。

图41995—1997年云南省BTV分离毒株Seg-7系统发生树

◆为本研究中分离的BTV毒株；树图节点的数值表示重复1000次的自举检验可信值。

图51995—1997年云南省BTV分离毒株Seg-10系统发生树

◆为本研究中分离的BTV毒株；树图节点的数值表示重复1000次的自举检验可信值。

Western地域型BTV毒株侵入云南省后，在传播过程中与我国本地流行毒株发生了基因重配，与同属环状病毒属的流行性出血病病毒（epizootichemorrhagicdiseasevirus,EHDV）某些血清型间Seg-7较难发生重配不同[28,29],BTV毒株的Seg-7片段能够在自然环境中发生相对自由的重配，提示BTV进化可能主要由基因重配驱动，使病毒更适合在当地的生态系统中传播和生存[20]。

本研究通过分析1995—1997年分离自云南省分属7种血清型的25株BTV毒株Seg-2、-3、-7和-10的遗传特征，发现云南省存在多种血清型BTV流行，既有本地长期流行的BTV-1型和BTV-16型毒株，也有Western地域型BTV毒株侵入云南省后发生重配的毒株，提示我国BT防控形势十分严峻。本研究为分析我国BTV毒株的突变和基因重配提供了第一手资料，为追溯我国BTV毒株来源提供了依据。

参考文献：

[19]韩春来,李全录,卢旺.国内外蓝舌病检测技术研究进展[J].中国动物检疫,2012,27(1):67-69.

[23]李占鸿,王金萍,杨恒,等.蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离[J].畜牧兽医学报,2019,50(2):130-139.

李卓然,朱建波,廖德芳,肖雷,王金萍,高林,杨振兴,李占鸿,杨恒,李华春.云南省蓝舌病病毒“历史毒株”的遗传特征[J].中国动物检疫,2020,37(08):26-35+42.

基金:国家重点研发计划项目(2017YFC1200505);国家自然科学基金项目(31760744);公益性行业(农业)科研专项(201303035);云南省中青年学术和技术带头人后备人才培养项目(2017HB055);云南省基础研究计划项目(2019FB041).