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文章亮点—

△缺氧预处理已被应用于提高骨髓间充质干细胞的生存力和改善其移植治疗的效率；缺氧预处理骨髓间充质干细胞移植后存活率增加，凋亡减少，分泌细胞因子能力增强，此效应主要由缺氧诱导因子1α所调控，但下游机制未明；

△该研究探讨MALAT1在缺氧预处理促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生中的作用，为阐明缺氧预处理介导骨髓间充质干细胞生存和血管再生的分子机制提供理论和实验依据。

文题释义：

缺氧诱导因子1α：是细胞对缺氧产生应答和适应的关键转录因子，其在缺氧预处理介导的效应中发挥重要调控作用。骨髓间充质干细胞内缺氧诱导因子1α表达上调能够参与代谢和多能性的维持。缺氧诱导因子1α表达增高或者稳定性增加后骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力和血管再生能力显著增强，且移植疗效得到进一步改善。

长链非编码RNA-MALAT1:MALAT1属于长链非编码RNA家族的重要成员之一，在哺乳动物进化中高度保守并在进化过程中扮演了重要角色。MALAT1被证实是受缺氧因素调控的长链非编码RNA之一，其在缺氧条件下表达增高并且调控了一系列生物学过程包括细胞增殖、分化及血管形成等。近年来研究发现MALAT1与骨髓间充质干细胞的扩增和血管形成密切相关。

缺氧预处理已被应用于提高骨髓间充质干细胞的生存力和改善其移植治疗的效率。缺氧预处理骨髓间充质干细胞移植后存活率增加，凋亡减少，分泌细胞因子能力增强，在改善心功能和血管再生方面表现出更为显著的优势[1,2]。然而到目前为止，缺氧预处理骨髓间充质干细胞产生上述效应的具体机制仍未完全明确。

研究显示缺氧能够增强骨髓间充质干细胞的生物学功能和活性[3,4,5]。缺氧介导的效应主要由缺氧诱导因子1α(hypoxiainducedfactor-1α，HIF-1α)所调控，HIF-1α表达上调后能够提高骨髓间充质干细胞的生存力和血管再生能力[6,7]。证据显示血管内皮生长因子A促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生，而HIF-1α能够上调VEGFA表达[3,7,8]。

长链非编码RNA在干细胞生存及血管再生中的调控作用近年来备受关注[9,10,11]。肺腺癌转移相关转录本1属于lncRNA家族重要成员，研究发现MALAT1能够通过诱导VEGFA的表达促进骨髓间充质干细胞生存和血管形成[12,13]，而缺氧条件下，HIF-1α能够上调MALAT1的表达[14,15]。该研究拟在体外探讨缺氧预处理是否通过激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生，以期为阐明缺氧预处理介导骨髓间充质干细胞生存和血管再生的相关分子机制提供一定的理论和实验依据。

1、材料和方法

1.1设计

细胞学体外观察实验。

1.2时间及地点

2019年1至6月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

1.3材料

1.3.1实验动物

3周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠10只，体质量10g左右，由中山大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2016-0029，用于骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定和血管形成实验。

1.3.2实验仪器及试剂

超净工作台、恒温CO2培养箱、酶标仪(multiscanMK3)(Thermo，美国)；台式常温高速离心机、微量移液器(Eppendorff，德国)；电热恒温水槽(上海深信实验仪器有限公司)；高温灭菌器(樱花牌NSS-20，日本)；缺氧培养箱(Eppendorf/Galaxy®48R，美国Eppendorf/Galaxy公司)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)；倒置光学显微镜(CKX41,U-CTR30-2，日本OLYMPUS公司)；巴氏吸管(美国JETBIOFIL公司)；胎牛血清、DMEM培养基、双抗、胰蛋白酶、PBS(Hyclone公司)；cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(美国Promega公司)；TUNEL试剂盒(美国Promega公司)；6孔、24孔板、48孔板细胞培养板(美国CORNING公司)；12孔、96孔板细胞培养板(美国NEST公司)；原代人脐静脉内皮细胞(广州奕源生物科技有限公司)；Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen，美国)；Matrigel(美国BD公司)；VEGFA兔单克隆抗体(Abcam，英国)；HIF-1α兔单克隆抗体(CellSignalingTechnology，美国)。

1.4实验方法

1.4.1细胞分组

(1)检测缺氧预处理的效应：分为常氧对照组和缺氧实验组；(2)验证HIF-1α的作用：分为常氧组、缺氧组、缺氧+si-HIF-1α组和缺氧+si-HIF-1α对照组，其中缺氧+si-HIF-1α组和缺氧+si-HIF-1α对照组分别转染HIF-1αsiRNA和相应的阴性对照再进行缺氧处理；(3)验证MALAT1的作用：分为常氧组、缺氧组、缺氧+si-MALAT1组和缺氧+si-MALAT1对照组，其中缺氧+si-MALAT1组和缺氧+si-MALAT1对照组分别转染MALAT1siRNA和相应的阴性对照再进行缺氧处理。1.4.2C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养采用全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞。将第3代骨髓间充质干细胞用于后续实验研究。骨髓间充质干细胞表现为CD34和CD45阴性，CD29和CD44阳性，具体方法及鉴定参照课题组文献[11,16,17,18]。

1.4.3细胞培养

常氧培养(对照组)：体积分数为20%O2条件下培养24h。缺氧处理(实验组)：缺氧前1d对细胞株进行传代，接种第3代细胞于25cm2培养瓶培养至90%-95%融合后，当天更换培养基，置于体积分数为1%O2、5%CO2、94%N2Galaxy®48R培养箱中培养24h，收集细胞及上清备用[16,17,18]。

1.4.4MTS检测细胞增殖能力

细胞培养24h后，消化细胞再吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×108L-1，接种到96孔板，每孔100μL，待细胞贴壁后，收集细胞进行检测[11,16,17,18]。

1.4.5TUNEL法检测细胞凋亡情况

细胞培养24h，取出爬片，采用TUNEL法检测细胞凋亡[11,16,17,18]。

1.4.6血管形成实验

48孔板中每孔加入200μLMatrigel37℃包被2h。取2×104人脐静脉内皮细胞重悬于200μL骨髓间充质干细胞培养上清液中，加入到已经包被的48孔板中，常氧条件下培养6h，再进行拍照及计数[11,16,17,18]。

1.4.7细胞转染

按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行转染[11,19]。转染前1d对细胞株进行传代，使其汇合度达到70%-80%，转染时采用Opti-MEM培养基。24孔板每孔加入质粒1μg，稀释到100μL培养基制作为A液，取1μLLipofectamine2000溶解于培养基制作为B液，B液混合5min后再将A液和B液混合，静置20min，将混合液加至细胞培养板并孵育4-6h后更换为完全培养基。相应的siRNA及阴性对照见表1。

1.4.8qRT-PCR检测HIF-1α、MALAT和VEGFAmRNA表达

细胞培养24h后收集并提取总RNA进行分析。取8μL总RNA液于70℃水浴5min，加入17μL反转录反应液，42℃孵育60min后终止反应。qRT-PCR扩增参数见前期文献[11,17,18,19]。反应结束后，软件自动计算定量结果，具体方法及步骤参考课题组文献[11,17,18,19]，具体引物设计见表2。

表1|siRNA及阴性对照序列

表2|qRT-PCR引物序列

1.4.9Westernblot检测HIF-1α和VEGFA的蛋白表达

1mL裂解液加10μLPMSF(100mmol/L)和10μLCocktail，摇匀并置于冰上。每管细胞加100μL含PMSF和Cocktail的裂解液，冰上裂解30min后4℃离心10min(14000r/min)，再提取各组细胞上清液总蛋白并采用BCA法测定样品蛋白浓度，具体参考课题组文献[11,17,18,19]。

1.5主要观察指标

(1)各组细胞增殖、凋亡和血管形成情况；(2)各组细胞相关通路分子表达情况。

1.6统计学分析

采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以x-±s表示，经检验数据符合正态分布，两组之间的差异比较采用两独立样本t检验，多组之间的差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用bonferroni法，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1骨髓间充质干细胞增殖能力

两组0h时A490值差异无显著性意义，而实验组缺氧暴露24h后A490值明显高于常氧对照组(0.510±0.003vs.0.410±0.002,t=-48.038,P<0.01)，见图1A，缺氧24h的细胞增殖率也较常氧对照组显著升高[(292.3±1.1)%vs.(215.38±0.57)%,t=-107.541,P<0.01]，见图1B，表明缺氧预处理能够促进骨髓间充质干细胞的生存。

2.2骨髓间充质干细胞凋亡情况

常氧对照组和缺氧实验组的凋亡比例分别为(15.67±1.24)%和(7.67±0.23)%，缺氧实验组显著低于常氧对照组(t=10.987,P<0.01)，见图2。

2.3血管形成能力

缺氧实验组和常氧对照组血管腔样结构的数量分别为15.00±1.00和3.00±0.67，缺氧实验组血管腔样结构的数量较常氧对照组明显增多(t=-17.267,P<0.01)，见图3。

2.4缺氧预处理后通路因子表达

采用westernblot检测各组细胞HIF-1α和VEGFA的蛋白表达，采用qRT-PCR检测各组细胞HIF-1α、MALAT1以及VEGFA的mRNA表达。结果显示：与常氧对照组相比，缺氧实验组HIF-1α和VEGFA的蛋白表达均显著升高，差异有显著性意义(HIF-1α：t=-24.664,P<0.01;VEGFA:t=-37.232,P<0.01)，见图4A。缺氧实验组HIF-1α、MALAT1以及VEGFA的mRNA表达量均高于常氧对照组，差异有显著性意义(HIF-1α：t=-18.948,P<0.01;MALAT1:t=-42.845,P<0.01;VEGFA:t=-57.552,P<0.01)，见图4B。

图1|骨髓间充质干细胞的增殖情况

图注：图中A可见缺氧实验组24h的A490值明显高于常氧对照组(aP<0.01);B可见缺氧实验组细胞增殖率明显高于常氧对照组(aP<0.01)

图2|骨髓间充质干细胞的凋亡情况

2.5抑制相关因子后下游分子的表达

在抑制HIF-1α和MALAT1的基础上进行缺氧预处理，采用westernblot检测各组细胞HIF-1α和VEGFA的蛋白表达，采用qRT-PCR检测各组细胞HIF-1α、MALAT1和VEGFA的mRNA表达。与常氧对照组相比，缺氧实验组HIF-1α和VEGFA的蛋白表达显著增高(P<0.01)，见图5A,HIF-1α、MALAT1和VEGFA的mRNA表达量显著升高(P<0.01)，见图5B。与缺氧实验组和缺氧+si-HIF-1α对照组相比较，缺氧+si-HIF-1α组HIF-1α、MALAT1和VEGFA的表达均出现显著下降(P<0.01)，见图5A和5B。与缺氧实验组和缺氧+si-MALAT1对照组相比较，缺氧+siMALAT1组MALAT1和VEGFA的表达亦显著下降(P<0.01)，见图6A和6B，而各个siRNA对照组与缺氧实验组相比，上述因子表达差异无显著性意义(P>0.01)，见图5和图6。

3、讨论

骨髓间充质干细胞被认为是治疗心血管疾病的理想种子细胞，但目前其移植治疗效率仍达不到理想水平[20,21]。近年来研究显示缺氧预处理能够提高骨髓间充质干细胞的生存力和血管形成能力进而增强其移植治疗的效果[22]。缺氧预处理骨髓间充质干细胞抗凋亡基因和促血管形成相关基因的表达增加，从而在移植后更好地促进了新生毛细血管生成和发挥对心功能的改善作用[1,23]。然而，缺氧预处理促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生的具体分子机制尚未完全明确。研究显示氧体积分数在调节骨髓间充质干细胞的增殖、分化及自我更新中具有重要作用[24]，而缺氧能够增强骨髓间充质干细胞的扩增和迁移能力并抑制其凋亡[25]。该实验首先对体外培养的骨髓间充质干细胞进行缺氧预处理，并采用常氧作为对照，在缺氧暴露24h后检测细胞增殖、凋亡及血管形成情况。结果显示：缺氧预处理后细胞增殖显著增加，凋亡减少，并且血管腔样结构明显增多，以上与既往研究结论相一致，表明缺氧处理能够提高骨髓间充质干细胞的生存和血管形成能力。在此基础上进一步探讨相关分子机制。

图3|骨髓间充质干细胞的血管形成情况

图4|缺氧后相关通路因子的表达

图注：图中A为westernblot检测结果；B为qRT-PCR检测结果。与常氧对照组相比，缺氧实验组HIF-1α和VEGFA的蛋白表达量显著增加(aP<0.01),HIF-1α、MALAT1和VEGFA的mRNA表达量均明显增高(aP<0.01)。HIF-1α：缺氧诱导因子1α；VEGFA：血管内皮生长因子A

HIF-1α是细胞对缺氧产生应答和适应的关键转录因子[26]。缺氧状态下，HIF-1α表达上调并参与了骨髓间充质干细胞的代谢和多能性的维持[3,6]。已有学者发现改善HIF-1α的稳定性或增强其表达后，骨髓间充质干细胞在体内外缺氧环境中的生存力和血管再生能力显著提高[23,27]。研究显示通过缺氧预处理增加骨髓间充质干细胞内HIF-1α表达能够增强细胞的抗凋亡能力和氧化应激能力，进而提高细胞生存力并改善移植治疗的效率[7,27]。由上可见，HIF-1α在缺氧预处理骨髓间充质干细胞所介导的效应中发挥了关键的调控作用。为明确HIF-1α的作用，该实验对体外培养的骨髓间充质干细胞进行缺氧预处理并检测HIF-1α的表达，结果显示缺氧预处理后HIF-1α的蛋白和mRNA表达均明显升高。以上表明缺氧预处理后HIF-1α被激活，其表达上调促进了骨髓间充质干细胞生存和血管再生。因HIF-1α发挥作用的下游信号尚未明确，进一步对相关下游分子进行了探究。

图5|抑制HIF-1α后下游分子表达变化

图注：图中A为westernblot检测结果，B为qRT-PCR检测结果。与常氧对照组相比，缺氧实验组HIF-1α、MALAT1和VEGFA表达均显著增高(aP<0.01)。与缺氧实验组和缺氧+si-HIF-1α对照组相比较，缺氧+si-HIF-1α组HIF-1α、MALAT1和VEGFA的表达均显著下降(bP<0.01,cP<0.01)。1：缺氧实验组；2：常氧对照组；3：缺氧+si-HIF-1α组；4：缺氧+siHIF-1α对照组。HIF-1α：缺氧诱导因子1α；VEGFA：血管内皮生长因子A

研究表明VEGFA是骨髓间充质干细胞生存和血管再生的一个重要调节因子，上调其表达能够显著增强骨髓间充质干细胞的生存和血管再生[11,17,19]。缺氧能够诱导骨髓间充质干细胞产生和分泌VEGF[3,28,29]。现已发现HIF-1α促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生与其上调VEGF的表达密切相关[23,27,30]。目前已有报道缺氧预处理后骨髓间充质干细胞以HIF-1α依赖方式上调VEGF[3,8,31]。为明确HIF-1α是否通过上调VEGFA而产生相关效应，在体外对骨髓间充质干细胞进行缺氧预处理后检测VEGFA的表达，结果显示缺氧预处理后VEGFA的蛋白和mRNA表达均显著增高，以上表明缺氧预处理促进骨髓间充质干细胞的生存和血管再生与VEGFA的表达上调密切相关。实验进一步采用相应siRNA抑制HIF-1α表达并进行缺氧预处理，同时检测VEGFA的表达变化，与缺氧实验组和HIF-1αsiRNA阴性对照组相比，HIF-1α抑制组的HIF-1α表达明显下降，说明HIF-1α被成功抑制。在HIF-1α被抑制后，VEGFA的表达亦出现了显著降低，而HIF-1αsiRNA阴性对照组VEGFA的表达与缺氧实验组之间并无差异性。以上充分说明，缺氧预处理后HIF-1α可通过作用于VEGFA促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生。

HIF-1α能够上调VEGFA，但其调控VEGFA的机制鲜有报道。鉴于此，作者对可能发挥调节作用的中间因子做了进一步探索。lncRNA在蛋白调控中具有重要作用，且其与骨髓间充质干细胞生存和血管再生密切相关[9,10,11]。MALAT1被证实是受缺氧因素调控的lncRNA之一[32,33]。在缺氧条件下，MALAT1表达增高并且调控了一系列生物学过程包括细胞增殖、分化及血管形成等[12,32,34]。现有研究表明MALAT1不仅能够促进骨髓间充质干细胞以及血管内皮细胞的增殖[12,32]，也参与诱导血管形成[13,35]，有学者发现沉默或敲除MALAT1导致新生血管形成显著减少[32,36]。最新的研究亦显示MALAT1在骨髓间充质干细胞的扩增和血管形成中具有明确的促进作用[12]。于是，HIF-1α是否通过作用于MALAT1介导VEGFA表达上调，成为倍感兴趣的问题。在该研究中，与常氧对照组相比，缺氧预处理骨髓间充质干细胞后MALAT1的表达明显增高，表明MALAT1参与调控了缺氧预处理介导的相关效应。

图6|抑制MALAT1后下游分子表达变化

图注：图中A为westernblot检测结果；B为qRT-PCR检测结果。与常氧对照组比较，缺氧实验组MALAT1和VEGFA表达均显著增高(aP<0.01)；与缺氧实验组和缺氧+si-MALAT1对照组比较，缺氧+si-MALAT1组MALAT1和VEGFA的表达亦显著下降(bP<0.01,cP<0.01)。1：缺氧实验组；2：常氧对照组；3：缺氧+si-MALAT1组；4：缺氧+si-MALAT1对照组。VEGFA：血管内皮生长因子A

MALAT1是缺氧条件下HIF-1α发挥作用的一个重要下游信号分子，HIF-1α能够作用于MTLAT1的启动子促进MALAT1的表达[15,37]。另一方面，有证据表明MALAT1能够调节VEGFA的表达，其通过募集到VEGF的mRNA前体进而增强VEGFA的表达[13,38]。目前已发现MALAT1可通过直接上调VEGFA促进骨髓间充质干细胞的扩增和血管形成[12]。由此，作者推测缺氧预处理后HIF-1α可能通过作用于MALAT1介导VEGFA表达上调，进而促进了骨髓间充质干细胞生存和血管再生。在该研究中，与常氧对照组相比，缺氧预处理后HIF-1α、MALAT1和VEGFA的表达均明显增高，而采用siRNA抑制HIF-1α之后发现MALAT1和VEGFA的表达水平较缺氧实验组以及siRNA阴性对照组均显著降低，说明MALAT1和VEGFA可作为HIF-1α的下游因子发挥作用。进一步采用相应的siRNA沉默MALAT1，与缺氧实验组以及siRNA阴性对照组相比较，MALAT1的mRNA表达水平在MALAT1抑制组出现明显降低，表明MALAT1被成功抑制。MALAT1表达被抑制后，VEGFA的蛋白和mRNA表达也随之出现明显降低，以上说明VEGFA是MALAT1的一个下游因子，缺氧预处理后MALAT1能够通过调节VEGFA发挥作用。通过前述研究结果得出结论：缺氧预处理后HIF-1α产生增加，进而上调MALAT1表达，并由此介导了VEGFA的表达增加，从而促进了骨髓间充质干细胞生存和血管再生。

综上所述，该研究证实缺氧预处理促进了骨髓间充质干细胞生存和血管再生，并且提出此效应与HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路激活相关，为阐明缺氧预处理促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生的相关分子机制提供了一定的理论和实验依据。

作者贡献：第一作者参与了课题的设计；第一、二、三作者对课题予以实施，第四、五作者对实验方法及结果予以评估。参与人员均受过相应的专业培训，采用盲法评估。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金(81700242)”“广东省科技计划项目(2017A020215176)”“广东省医学科研基金(A2017001)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验中对动物处置方法取得中山大学伦理委员会批准，批准号：201900005。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经通过中山大学孙逸仙纪念医院生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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参考文献：

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基金:国家自然科学基金(81700242),项目负责人:侯婧瑛;广东省科技计划项目(2017A020215176),项目负责人:侯婧瑛;广东省医学科研基金(A2017001),项目负责人:侯婧瑛.