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基于细胞生物学开展自组装单分子层技术研究

2020-02-28 318 上传者：管理员

摘要：文章对蛋白吸附研究、细胞粘附研究、细胞-胞外基质相互作用的研究及干细胞研究中自组装单分子层技术的应用进行了综述，并对表面图案化和制备多种配体的模型表面等方面的发展进行了阐述。

关键词：
细胞生物学
细胞粘附
自组装单分子层技术
蛋白吸附
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自组装单分子层技术的产生，为研究者控制表面分子结构，进行细胞生物学的相关研究，提供了一个非常优秀的平台。

1、蛋白吸附研究

材料表面的化学性质是细胞吸附的物质基础。细胞吸附的数量、密度、取向等依赖于基质表面的理化性能。基质表面的理化性质可使蛋白质由原来构象完整、二级或三级结构不受影响的状态，逐渐转变成有一定程度变性的状态，如蛋白质失去了二级或三级结构、出现折叠中间体的吸附等；除此以外，蛋白质结构域变换的可能性也大大增加，这就是说当蛋白质在基质表面部分变性后，其中的一些结构域可能会与另一种蛋白质的结构域重组，其最终结果是使蛋白质完全变性，导致肽链完全解折叠，最终形成没有任何生理功能的无定型聚合物层。例如,在聚苯乙烯基底接种细胞前，通常会预吸附一层纤连蛋白或胶原，提高细胞的粘附性。这些吸附在材料表面的蛋白质在结构上存在异质性，即它们可能存在多种取向和构象，但是其中总会有一种能够增强细胞粘附、铺展和迁移的功能性构象存在。

同时，蛋白质也有可能非特异性地吸附到材料表面，这种性质对存在细胞键合位点的模型表面具有很大的影响。例如，当材料处于细胞悬液中时，血清中的蛋白可以快速吸附到材料表面，阻止已经固定在材料表面的蛋白发挥作用。不过，有多种方法可以用来解决这个问题，其中最简单的就是用封闭蛋白来处理材料表面，最常用的封闭蛋白是牛血清白蛋白。将固定了功能蛋白的表面再浸入牛血清白蛋白中，使没有结合蛋白的表面空隙被牛血清白蛋白封闭，避免了培养液中蛋白与表面非特异性吸附。

2、细胞粘附研究

自组装单分子层技术已经成功应用于功能肽在细胞粘附和迁移中作用的研究，在早些时候研究者就已经成功制备了由Gly-Arg-Gly-Asp-Ser多肽修饰的分子层表面，这种多肽存在于纤连蛋白和其它的一些细胞外基质中，它是大约一半整联蛋白家族的配体。通过研究发现，Swiss3T3成纤维细胞在该分子层上粘附和铺展状态良好，荧光免疫反应显示已经粘附的细胞形成了正常的黏着斑——一串整联蛋白受体与基底之间形成了强有力的连接，并且开始传递粘附信号，形成肌动蛋白丝。对照组实验显示，细胞粘附可由一种可溶性的RGD肽阻断，细胞在杂乱分布着这种肽的表面几乎不粘附。这项研究表明自组装单分子层确实可以用来研究介导细胞粘附的受-配体作用，也证明了有序的RGD肽可以促进细胞粘附、铺展和细胞骨架的重排。

自组装单分子层技术也可以用来进行生物机制的研究，估计细胞粘附对配体密度的依赖性。例如，细胞在混合了0.5%的三乙二醇表面表现出良好的粘附和铺展效果；而细胞在混合了六乙二醇的表面，粘附效果大大降低；对照实验显示表面配体浓度过高时，RGD肽的活性将有所降低。综上所述，自组装单分子层具有良好的结构特征，可以有效地应用于研究配体浓度和亲和力对细胞粘附行为的影响。

3、细胞-胞外基质相互作用的研究

纤连蛋白是一种在许多组织中发现的重要胞外基质蛋白，它包含超过30个球型结构域，其中Ⅲ型结构域对细胞粘附起到显著作用。RGD肽存在于第十个Ⅲ型结构域中，它是最早发现的介导细胞粘附的配体。自组装单分子层技术，为研究纤连蛋白配体在细胞粘附中的作用提供了一个良好的表面。最近的一些研究中，也涉及到了一种PHSRN序列肽，它存在于第九个Ⅲ型结构域中。PHSRN可以与RGD发生协同作用，共同增强细胞粘附，但当它单独存在时对细胞粘附起不到增强作用。有研究者认为产生这种现象的原因是RGD和PHSRN同时存在于纤连蛋白的粘附结构域中时，可以分别与整联蛋白上相对的分离位点相结合，从而促进粘附发生。

自组装单分子层可以消除研究工作中的不确定因素，研究单一变量对细胞粘附的影响，因而可以很好地应用于协同作用机制的研究中。有报道研究了RGD和PHSRN与整联蛋白键合，协同作用于细胞粘附的相关机制。首先，他们将细胞接种在只具有RGD或PHSRN的表面，发现在PHRSN表面细胞没有发生铺展现象。其次，PHSRN可以阻止细胞粘附到具有RGD的材料表面。这些结果说明两种肽可能与整联蛋白上同一键合位点相结合，或是键合的分离位点形成了异构连接。

4、干细胞研究

有研究者利用自组装单分子层建立了良好的细胞培养体系，来进行干细胞生物学的相关研究。他们在材料表面上构造了一些来自于层粘连蛋白的肽段阵列，然后将胚胎干细胞接种到上面，发现这些肽段的存在有利于干细胞的生长和自动更新。有人制备了一种存在多肽序列的三维支架材料表面，进行干细胞的培养和鉴定，发现多肽可以有效地增强干细胞的粘附。这些研究很好的证明了自组装单分子层可以在干细胞生物活性的研究中发挥重要的应用。

5、存在完整蛋白质结构域的模型表面

运用修饰了短肽序列的表面来模拟胞外基质和细胞相互作用是十分有效的，但是对于一些要求有蛋白质折叠结构存在的研究就不适用了。因此，制备一种表面存在完全蛋白质结构域的基底材料就显得十分必要。相比于在材料上吸附低分子量的配体，许多固定蛋白的方法很难控制蛋白的分子取向和密度。用His结尾的蛋白成功的进行了原位特异性固定，但是这种方法没有形成共价键的结合，很难保持长时间的稳定性。这些表面具有良好的细胞粘附活性，可以用来研究纤连蛋白的多种受-配体作用。该方法的优点在于角质酶和配体的相互作用是具有选择性的，因此它不要求蛋白质有很高的纯度就可以实现对蛋白质的密度和图案的控制。利用这种方法制备了具有多种配体的模型表面，更好地模拟胞外基质的性质。

6、图案化模型表面

自主装单分子层可以将细胞粘附配体图案化，控制粘附细胞的形状、尺寸和位置，这在基础生物学和应用生物学中具有极高的应用价值。表面图案化在最近几年是研究的活跃领域，并且有着长足的发展，产生了许多控制细胞粘附的方法和策略。其中，最简单和最重要的表面图案化方法是微接触印迹法，它是用一种橡皮图章在金基底上印下所需要的分子层和图案。首先，将覆盖有光致抗蚀剂的硅片暴露在紫外光下进行光刻腐蚀，形成具有所需图案的母版。然后，用这种母版制造具有相同图案的弹性印章。接着，用这种图案化的印章蘸取硫醇溶液，与金基底接触30s左右的时间，就会在金基底表面形成特定图案的自组装单分子层。最后，将基底浸入乙二醇结尾的硫醇溶液中，使未接触印章的金表面成为生物惰性表面。

许多研究中，还会在印章区域再吸附一层胞外基质蛋白，形成表面蛋白图案化。微接触印迹法操作简单，最小可以形成1平方微米尺寸的图案，最大可以形成几个平方厘米的图案，因此在表面修饰领域有着广泛的应用。早期的研究者用图案化分子层表面来探索细胞铺展和凋亡之间的关系，如人类毛细管内皮细胞可以粘附到具有75~3000平方微米方形图案平表面，表现出良好的粘附状态，粘附在较小图案上的细胞出现凋亡现象，但随着细胞铺展面积的增加，凋亡的细胞越来越少。还有许多研究者利用图案化的基底表面来研究粘附细胞的骨架结构。这些研究成果显示凹形可以增强收缩压力丝的组装，凸形可以增强板状伪足的组装，而具有点状图案的表面则可以增强黏着斑的结构。以上的这些成果，为后来的研究者提高粘附细胞的骨架结构和强度提供了很好的理论依据。在近些年，很多研究者也将图案化表面应用到了干细胞的研究当中。将间充质干细胞接种到方形图案表面，发现在尺寸较小的方形表面间充质干细胞分化为脂肪细胞，而在尺寸较大的方形表面则分化为骨细胞。

7、小结

自组装单分子层具有良好的结构特征。利用单分子层可以在材料表面修饰多种配体和功能基团，这种表面具有规则的分子结构，形成的表面配体浓度具有很大的变化范围，可以根据所模拟的环境不同来选择合适的浓度，也可以键合多种配体制备动力学基底。

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基金项目:泰州职业技术学院硕博基金（TZYBS-17-3）,泰州职业技术学院大学生创新创业训练计划项目（YJDC2019010）