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GLIS1基因表达和绵羊产羔数之间的关系探究

2020-12-03 229 上传者：管理员

摘要：为探究GLIS1基因表达水平与绵羊产羔数之间的关系，利用半定量RT-PCR(Semi-quantitativeRT-PCR,sqRT-PCR)和实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timePCR,qPCR)技术检测了绵羊GLIS1基因在不同产羔能力绵羊各组织中的表达情况。结果表明：GLIS1基因在多羔小尾寒羊输卵管高表达，在单羔苏尼特羊卵巢、输卵管、子宫体以及子宫角中的表达量均高于多羔小尾寒羊(P>0.05);GLIS1基因B+基因型在各组织中的表达量均极显著高于BB基因型和++基因型(P<0.01)。综上得出，GLIS1基因可能通过调控其mRNA表达水平对绵羊产羔数发挥负调控作用。

关键词：
GLIS1基因
产羔数
基因表达
绵羊
转录因子
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GLISl来源于转录因子中最大的家族-Kruppel样锌指蛋白，是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达的蛋白，在小鼠胚胎发育中的表达具有时空性[1]。GLIS1同时具有转录激活和转录抑制活性，能够对胚胎发育的特定阶段进行调控，对于小鼠的胚胎发育尤为重要，同时Gli蛋白的表达或活性又受其上下游BMP和Wnt蛋白家族的成员调控[2]。Takahashi等[3]检测体外培养条件下GLIS1基因在卵母细胞以及胚胎发育不同阶段的细胞中表达发现，该基因在卵母细胞中表达，且在牛胚胎发育过程中作用十分关键。王小海等[4]研究发现，GLIS1基因在小鼠的胚胎发育以及成纤维细胞的重编程过程中均发挥重要作用。胚胎发育能否成功将会直接对动物的生殖力产生影响，因此对影响胚胎发育过程的重要因子进行研究很有必要。

前期，本课题组利用绵羊全基因组重测序技术筛选到了与绵羊产羔数可能有关的候选基因GLIS1[5]。由于该基因在卵母细胞及胚胎发育中发挥重要作用，但在绵羊生殖调控中的作用尚未见报道，鉴于此，本研究以小尾寒羊（多产多羔，但也有部分产单羔）和苏尼特羊（几乎都产单羔）为研究对象，通过检测GLIS1基因在这两个绵羊品种与繁殖相关的组织中的表达，分析GLIS1基因表达与绵羊产羔能力之间的关联性，为绵羊产羔数主效基因的确定提供依据。

1、材料与方法

1.1实验动物及处理

实验中的小尾寒羊和苏尼特羊均饲养于天津市畜牧兽医研究所种羊场。每个组别选取年龄相近、生理状态一致的绵羊各3只进行屠宰，并在屠宰后迅速采集新鲜组织并装入2mL的RNase-Free冻存管中，并立即置于液氮中保存，带回实验室后全部转移至-80℃保存备用。

1.2引物设计

根据GenBank提供的绵羊GLIS1基因mRNA序列（登录号为：XM＿015091666.1），利用Primer3在线软件进行跨外显子引物设计，以β-actin(NM＿001009784）作为内参基因。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物具体信息见表1。

表1引物信息

1.3sqRT-PCR和qPCR反应

利用反转录试剂盒反转录合成cDNA，将反转录产物5倍稀释，用持家基因β-actin进行PCR扩增，利用cDNA为模板进行sqRT-PCR和qPCR反应，qPCR检测利用RocheLightCycler誖480Ⅱ型荧光定量PCR仪进行，每个样品重复检测3次。实验中所有PCR和sqPCR产物均通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳验证。

1.4数据分析

采用2-ΔΔCt法[6]对qPCR结果中目的基因的相对表达量进行计算，之后利用SPSS20.0软件中比较均值和一般线性模型单因素方差分析中的最小显著差异法对各组别之间的基因表达量进行差异显著性分析。

2、结果与分析

2.1GLIS1基因在绵羊各组织中的sqRT-PCR表达特征

经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测发现，RNA完整性良好，且无明显降解，可直接进行反转录。反转录成cDNA后，同时用GLIS1和β-actin引物进行PCR扩增，得到的目的片段与预期的80bp和97bp一致，且条带单一，于是将引物和cDNA用于后续的qPCR试验。在进行qPCR之前，先利用sqRT-PCR技术对GLIS1和β-actin在小尾寒羊和苏尼特羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺、卵巢、输卵管、子宫体、子宫角、瘤胃、大肠、小肠以及肾脂共19个组织中的总体表达情况进行了分析，结果见图1。

图1表明，GLIS1基因在两个绵羊的19个组织中为广谱表达，但除了在多羔小尾寒羊输卵管高表达、在脾脏和下丘脑中表达量较高以及在单羔苏尼特羊肝脏高表达以外，在其他各组织中均表现为表达较低的特征。

图1GLIS1和β-actin在绵羊组织中的sqRT-PCR结果

注：M.DL2000DNAMarker;1～19.心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、下丘脑、垂体、肾上腺、甲状腺、卵巢、输卵管、子宫体、子宫角、瘤胃、大肠、小肠和肾脂

2.2GLIS1基因在绵羊组织中的qPCR表达特征

2.2.1GLIS1基因在两个绵羊品种各组织间的表达

利用qPCR技术对GLIS1基因在多羔小尾寒羊和单羔苏尼特羊8个与繁殖性状相关组织中的表达比较发现，GLIS1基因在两个绵羊品种8个组织中均表达，虽然各组织间的表达均未达到差异显著水平（P>0.05），但可以看出，该基因在苏尼特羊4个重要繁殖组织卵巢、输卵管、子宫体和子宫角中的表达量均高于小尾寒羊（P>0.05），见图2。

图2不同绵羊品种各组织间GLIS1基因表达

2.2.2GLIS1基因在小尾寒羊FecB不同基因型间的表达特征

利用qPCR技术对GLIS1基因在多羔小尾寒羊FecB不同基因型个体（FecB基因是影响小尾寒羊产羔数的其中一个主效基因）8个与繁殖性状相关组织中的表达量比较发现，GLIS1在B+基因型各组织间的表达量均极显著高于BB基因型和++基因型（P<0.01），而BB基因型和++基因型均无显著性差异（P>0.05），结果见图3。

图3小尾寒羊FecB不同基因型各组织间GLIS1基因表达

注：相同组织中的不同字母之间表示差异极显著（P<0.01)

2.2.3GLIS1基因在++基因型单、多羔小尾寒羊间的表达特征

为排除FecB主效基因对产羔数的影响，利用qPCR技术进一步分析了GLIS1基因在++基因型单、多羔小尾寒羊大脑、小脑、下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫7个与繁殖性状相关组织中的表达特征，结果显示，无论是++基因型单羔还是多羔绵羊，GLIS1均表现为在大脑、小脑和垂体中高表达；且除了小脑和卵巢组织之外，在其他各组织中GLIS1的表达量均为++基因型单羔>++基因型多羔，但差异均未达到显著水平（P>0.05），结果见图4。

图4在++基因型单、多羔小尾寒羊间GLIS1基因表达

3、讨论

绵羊在我国家畜中占据重要地位，是三大家畜之一，但绝大多数绵羊产羔数低成为我国绵羊产业发展的主要限制因素[7,8,9]。因此，如何适当提高绵羊每胎的产羔数是养羊业亟待解决的一个科学难题。随着现代分子生物技术的迅速发展，高产羔数主效基因分子标记在绵羊生产中的应用可能是解决其产羔数低的有效方法。目前科学家已经定位了一些与绵羊产羔数相关的主效基因，其中最为著名的有BMPR1B[10,11,12]、BMP15[13,14]、GDF9[15,16]和B4GALNT2[17]等。然而绵羊的产羔数性状是一个受微效多基因调控的复杂性状，仅仅靠已经发现的高产羔数主效基因分子标记很难在整体上提高绵羊的产羔数，继续挖掘与产羔数相关的基因仍十分必要。本实验室前期通过全基因组重测序发现，GLIS1基因在单、多羔绵羊之间Fst值达到了显著水平，且目前尚未见GLIS1基因在绵羊繁殖上的报道，但已有其在小鼠胚胎发育中的相关报道[4]，而胚胎发育也是影响动物最终生殖力的一个重要阶段。因此，本研究对GLIS1基因在绵羊组织中的表达进行研究，旨在探讨其表达水平与绵羊产羔数之间的关联性，有助于加快绵羊产羔数主效基因的挖掘进程。

本研究通过sqRT-PCR技术对多羔小尾寒羊和单羔苏尼特羊19种组织GLIS1基因表达进行检测发现，该基因在绵羊各组织中呈现为广谱表达，但除了在多羔小尾寒羊输卵管和下丘脑以及单羔苏尼特羊的肝脏中表达量较高外，在其他组织中的表达量均较低。品种间的qPCR结果显示，GLIS1基因在单、多羔各组织间的表达均无显著性差异，在单、多羔绵羊卵巢、输卵管、子宫体以及子宫角中的表达量均较高，且在单羔苏尼特羊中的表达量高于多羔小尾寒羊，这与之前本实验室研究的FSTL1基因的表达模式非常相似[18]，表明GLIS1基因可能同FSTL1一样对于绵羊重要生殖器官卵巢、输卵管和子宫功能发挥与维持非常重要，另一方面又表明它与产羔数可能存在一定程度的负相关。GLIS1基因在小尾寒羊FecB不同基因型中的表达模式表明，该基因在B+型杂合子中可能发挥着与BB基因型和++基因型不同的作用，这可能也与之前报道的GLIS1同时具有转录激活和抑制活性有关[4]，但其究竟如何影响绵羊产羔数目前尚无法得出，有待于进一步研究。对++基因型单、多羔小尾寒羊各组织中GLIS1的表达进行了检测，发现其在繁殖组织中的表达模式与不同绵羊品种间的结果基本一致，即在单羔卵巢、输卵管和子宫中的表达量均高于多羔，可能在绵羊的繁殖组织中发挥负调控作用。

4、结论

GLIS1基因在单、多羔绵羊各组织中广泛表达，其表达水平与绵羊产羔数之间可能存在一定程度的负相关，且在FecB信号通路中可能发挥一定作用。以上结果可为高产绵羊的选育提供依据。

参考文献：

[4]王小海,杨力侠,吴勇延,等.小鼠Gli-similar-l(Glis1)基因新转录本功能分析[J].农业生物技术学报,2012,20(7):815-821.

[8]周梅,曹晓涵,贺小云,等.绵羊FGF7基因组织表达及其多态性与产羔数之间的关系[J].畜牧兽医学报,2018,49(3):522-533.

[9]田志龙,汤继顺,孙庆,等.绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析[J].中国农业科学,2019,52(4):755-766.

[18]周梅,曹晓涵,贺小云,等.绵羊FSTL1基因组织表达及其多态性与产羔数之间的关系[J].农业生物技术学报,2018,26(5):77-86.

周梅,狄冉,胡文萍,王翔宇,王重龙,张效生,张金龙,刘秋月,储明星.GLIS1基因表达与绵羊产羔数之间关系的研究[J].中国草食动物科学,2020,40(06):6-9+31.

基金:国家转基因科技重大专项(2016ZX08009-003-006和2016ZX08010-005-003);国家自然科学基金项目(31772580);国家肉羊产业技术体系专项(CARS-38);中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS13);农业科研杰出人才及其创新团队项目(农办人[2015]62号);国家万人计划科技创新领军人才项目(W02020274);天津市农业科技成果转化与推广项目(201704020);博士启动基金.