间充质干细胞存在于人体的许多器官和组织中，它们具有再生和分化潜能，在修复体内受损组织方面起着重要作用[1,2]。成体间充质干细胞已在骨髓、脂肪、血液、肠道、皮肤、肌肉、脐带等组织中被鉴定，其存在着数量有限、分离涉及侵入性、诱发供体部位疾病、捐助者异质性等缺点[3,4]。这些问题使得研究者对围产期干细胞的研究产生了兴趣，围产期组织可以非侵入性获得，从新生儿出生时伴随的组织中分离，具有来源易得和伦理争议少的优点[5,6]。从脐带中可提取出具有增殖和多向分化潜能的人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcord-mesenchymalstemcells,hUC-MSCs)[7]。

脐带组织中分离人脐带间充质干细胞的方法包括酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法使用蛋白水解酶类分解组织基质释放细胞，这种方法可快速收集细胞；组织块贴壁方法是将小块的组织贴附在塑料培养平面上进行培养，细胞自然爬出的同时富集形成集落。两种方法各有优劣，至今还没有一种分离方法被视为统一的标准。对于酶消化方法，其酶类型、用量、消化时间等是关键因素，消化过程可能会损伤脐带间充质干细胞[8,9]。与酶消化法相比，组织块贴壁法具有简单、经济、细胞损害小等优势，但较长的培养周期限制了其应用。

组织工程应用中需要大量的种子细胞，细胞的体外培养是一个重要问题。研究表明，细胞传统二维培养以单层形式增殖，二维贴壁导致细胞扁平化和细胞骨架的改变，进一步改变了基因和蛋白质的表达[10,11]。为了解决干细胞二维培养所面临的局限性，现通过各种方法构建仿生微环境，其中细胞球是通过细胞自组装聚集形成的三维结构球形组织[12]，已是现今组织工程中较为常见的一种三维培养方式。研究表明，与二维培养干细胞相比，三维球形培养干细胞具有更高的干性，并展示更好的分化潜能[13]。

目前对这两种分离方法提取人脐带间充质干细胞的生物学特性比较的研究较少，且局限在二维培养条件下细胞增殖和免疫表型方面[14]。该研究进一步比较两种方法获取的人脐带间充质干细胞在二维、三维培养下的细胞增殖、免疫表型和干性转录因子表达，为今后组织工程和再生医学中种子细胞的提取方法及培养方式的选择提供指导。

1、材料和方法

1.1 设计

体外细胞学实验。

1.2 时间及地点

实验于2020年4月至2021年2月在赣南医学院科研中心省重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 脐带

10份脐带标本均取自健康足月顺产或剖宫产的新生儿，产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病。由赣南医学院第一附属医院提供，产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验试剂

LG-DMEM、胎牛血清(BiologicalIndustries公司)；Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；PBS、青霉素、链霉素(北京索莱宝科技有限公司)；阿尔玛蓝细胞活力试剂(Invitrogen公司)；细胞死活检测染色液(苏州宇恒生物科技有限公司)；流式相关抗体均购买于Invitrogen公司，包括FITC-anti-human-CD34、FITC-antihuman-CD90、PE-anti-human-CD44、PE-anti-human-CD45、PE-antihuman-CD105；小鼠抗人SOX2单克隆抗体(R&DSystems)；小鼠抗人NANOG、OCT4单克隆抗体(SantaCruzBiotechnology)；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(Proteintech);HRP-anti-mouseIgG(CST);FITC-山羊抗小鼠IgG、DyLight550-山羊抗小鼠IgG、即用型山羊血清、DAPI染色液、Tris-HCl(武汉博士德生物)；RIPA裂解液(强)、脱脂奶粉、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术)；0.45μmPVDF膜(Millipore)。

1.3.3 实验仪器

无菌超净工作台(苏净安泰)；恒温细胞培养箱(ThermoScientific)；倒置相差光学显微镜(LEICADMi1)；激光共聚焦显微系统(Zeisscarlzeislsm880)；扫描电镜(Tescan)；垂直电泳仪(Bio-rad)；化学发光成像曝光系统(Annalytikjena)；台式低温高速离心机(eppendorf)；纯水机(Millipore)；制冰机(Panasonic)；检测型流式细胞仪(BDFASCantoⅡ)；多功能酶标仪(ThermoScientific);37℃恒温摇床(上海知楚仪器有限公司)，超低吸附96U型孔板(美国Corning公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的提取分离、培养和扩增

将手术室取下的健康足月生产的婴儿脐带放入无菌生物取样袋中，浸泡于胎盘运输液，通过冷藏生物安全运输箱尽快送达生物实验室进行提取操作。超净台内取出脐带，1%双抗-PBS充分洗涤残留的血渍，用组织剪剪碎至1mm3大小组织块，参考JENSEN等[15]的组织块贴壁培养方法，预先用3mL含体积分数20%胎牛血清的LG-DMEM完全培养基润湿10cm培养皿，将一部分组织块用镊子分散接种于培养皿中，注意不要出现组织块漂浮。同时，参考ZHANG等[16]的酶消化法，将剩余组织块用等体积1g/LⅠ型胶原酶37℃摇床振荡消化两三个小时，消化后液体经过200目滤网过滤，离心富集，用含体积分数20%胎牛血清的LG-DMEM完全培养基重悬接种于T25细胞培养瓶中。两种方法分离的细胞均放置在37℃细胞培养箱内培养，倒置相差显微镜下每天观察，每3d更换1次培养基。组织块贴壁法待细胞出现集落生长融合至80%以上，弃组织块，用0.25%胰蛋白酶消化传代；酶消化法待细胞生长至80%融合，用0.25%胰蛋白酶消化，均以1∶3比例传代，第3代细胞形态均一呈梭形，用作后续实验。

1.4.2 三维球形培养方法

选择第3代状态良好的脐带间充质干细胞，弃培养基并用PBS轻轻漂洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化，用含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM完全培养基终止消化，1200r/min离心5min，完全培养基重悬细胞沉淀制得细胞悬液，最后以4×103/孔密度接种于超低吸附96U型孔板中，放置于37℃细胞培养箱培养至聚集成细胞球。

1.4.3 实验分组

分别采用酶消化法和组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞，扩增培养后，取第3代状态良好的细胞用于二维平面培养和三维球形培养进行后续实验，分别为酶消化法提取细胞的二维培养(消化法-二维组)，组织块贴壁法提取细胞的二维培养(贴壁法-二维组)，酶消化法提取细胞的三维球形培养(消化法-三维组)，组织块贴壁法提取细胞的三维球形培养(贴壁法-三维组)。

1.5 主要观察指标

1.5.1 细胞形态观察

倒置相差显微镜下观察酶消化法和组织块贴壁培养法提取细胞的生长过程和三维成球效果，并拍照记录。

1.5.2 扫描电镜观察细胞球表征

三维球形培养3d后收集细胞球，PBS漂洗2次，40g/L多聚甲醛固定15min，之后依次用体积分数为50%,75%,90%,100%乙醇梯度脱水，每次5min，将细胞球转移分散到电镜载物台上真空喷金后，扫描电镜TESCANVEGA3LM拍摄观察。

1.5.3 死活染色观察细胞球存活情况

三维球形培养3d后收集细胞球，PBS漂洗2次转移至6孔板中，事先2μL2mmol/LEthD-Ⅰ和1μL4mmol/LCalceinAM与1mLPBS混合配置死活染色工作液，加入到6孔板中室温避光孵育15-20min，倒置荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.5.4 AlamarBlue检测细胞增殖情况

选择生长状态良好的第3代两种提取方法分离的人脐带间充质干细胞，以3×103/孔的细胞密度分别接种到普通96孔板和超低吸附96U型孔板中以二维和三维球形的方式进行培养，每次设置3个复孔，放入37℃细胞培养箱，每3d更换1次培养基，分别在第1-7天，吸弃培养基，换成含10%AlamarBlue的培养基，孵育5h，将培养液转移至96孔全黑酶标板中，以吸收峰545nm，散射峰590nm测定最大荧光发光值。

1.5.5 流式细胞术检测免疫表型

选择生长状态良好的第3代两种提取方法分离的人脐带间充质干细胞进行二维和三维细胞球形培养，二维培养以1×108L-1的细胞浓度接种到10cm培养皿中(每皿10mL)；三维球形培养以4×103/孔的密度接种到超低吸附96U型孔板中，放入37℃细胞培养箱。每日观察，第4天取出用0.25%胰蛋白酶消化吹打制备成单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤2次后重悬于500μLPBS，除阴性对照管外分别加入5μL的FITC-CD34、FITC-CD90、PE-CD44、PE-CD45、PE-CD105抗体，4℃避光孵育30min,PBS洗涤2次后重悬于500μLPBS，上流式细胞仪检测分析，FlowJo软件处理数据。

1.5.6 免疫荧光检测多能性转录因子的表达

选择生长状态良好的第3代两种提取方法分离的人脐带间充质干细胞进行二维和三维细胞球形培养，二维培养以1×104/皿的细胞密度接种到共聚焦皿中；三维球形培养以4×103/孔的密度接种到超低吸附96U型孔板中，放入37℃细胞培养箱。每日观察，第4天取出超低吸附96U型孔板吸取收集足量细胞球转移到共聚焦皿，二维培养共聚焦皿则直接进行下面步骤：37℃预热的PBS轻轻漂洗细胞2次；40g/L多聚甲醛室温固定20min,PBS漂洗3次，每次5min;0.5%TritonX-100处理细胞10min,PBS漂洗3次，每次5min；即用型山羊血清封闭2h；弃封闭液，加入200μL按1︰50稀释的小鼠抗人SOX2单克隆抗体、小鼠抗人NANOG单克隆抗体、小鼠抗人OCT4单克隆抗体，4℃孵育过夜；弃一抗，PBS洗涤3次，每次5min，加入200μL按1︰50稀释的FITC-山羊抗小鼠IgG或者DyLight550-山羊抗小鼠IgG,37℃孵育2h,PBS洗涤3次，每次5min，操作过程注意避光；DAPI染色10min,PBS洗3次，每次5min；封固后激光共聚焦显微镜拍照观察。

1.5.7 Westernblot检测多能性转录因子的表达

选择生长状态良好的第3代两种提取方法分离的人脐带间充质干细胞进行二维和三维细胞球形培养，二维培养以1×108L-1的细胞浓度接种到10cm培养皿中(每皿10mL)；三维球形培养以4×103/孔的密度接种到超低吸附96U型孔板中，放入37℃细胞培养箱。每日观察，第4天取出超低吸附96U型孔板，吸取收集细胞球，PBS洗涤2次，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解20min；二维培养的培养皿用PBS洗涤2次，加入RIPA细胞裂解液，细胞刮收集细胞，冰上裂解20min，裂解后以12000r/min低温离心15min，收集上清液，即为细胞总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量后，稀释分装成同一浓度，加入5×蛋白上样缓冲液混合，于金属浴中100℃煮10min，冷却后放入-80℃保存。将20μg提取的蛋白样品在10%SDS-PAGE分离凝胶上电泳，将分离后的蛋白条带转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶中室温封闭2h，转移至稀释的小鼠抗人SOX2、NANOG、OCT4、GAPDH抗体4℃孵育过夜，TBST漂洗3次×10min，加入相应的二抗室温孵育2h,TBST洗涤3次×10min,ECL化学发光显色，应用化学发光成像系统拍照成像。ImageJ软件半定量分析。

1.6 统计学分析

采用SPSS22.0软件建立数据库并进行统计学分析，实验数据均以表示，采用One-wayANOVA方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 细胞形态学观察结果

酶消化法分离提取第1天观察到极少量细胞贴壁，第3天可见部分细胞贴壁且呈梭形伸展，在第11天细胞融合密度可以达到85%；组织块贴壁法分离提取第7天以后可见细胞从组织块边缘爬出，第13天细胞融合密度可达到85%，见图1。

酶消化法细胞获取时间比组织块贴壁法更短。两种方法提取的细胞进行三维球形培养都能自发聚集，在24h后形成直径在200-300μm的细胞球体；扫描电镜观察可见培养3d的细胞球中细胞和细胞紧密结合；死活染色观察到培养3d后细胞球外部细胞存活状况良好，中心部分少量细胞凋亡，见图2。

2.2 细胞增殖能力检测结果

在二维培养条件下，两种方法提取的人脐带间充质干细胞生长曲线都呈现“缓滞-对数生长-平台”的模式，酶消化法提取的人脐带间充质干细胞前4d处于缓滞阶段，第4-6天为对数生长期，第6天后进入平台期；组织块贴壁法提取的人脐带间充质干细胞前2d处于缓滞阶段，第2-3天为对数生长期，第3天后进入平台期。在三维球形培养条件下，酶消化法和组织块贴壁法提取的人脐带间充质干细胞增殖缓慢，见图3。

2.3 人脐带间充质干细胞免疫表型表达

两种原代分离方法提取的人脐带间充质干细胞在二维培养条件下强表达CD44、CD90、CD105，阴性表达CD34、CD45。二维培养下CD44、CD90的表达无差异；酶消化法CD105的表达(89.03±0.12)%高于组织块贴壁法(71.04±0.64)%，差异有显著性意义(P<0.05)。在三维培养条件下强表达CD44、CD90，弱表达CD105，阴性表达CD34、CD45。三维培养下CD44的表达无差异；酶消化法CD90的表达(94.50±0.36)%高于组织块贴壁法(84.23±0.56)%，差异有显著性意义(P<0.05)；酶消化法CD105的表达(16.37±0.63)%高于组织块贴壁法(6.66±1.63)%，差异有显著性意义(P<0.05)，见表1，图4。

2.4 人脐带间充质干细胞的多能性转录因子表达

免疫荧光与westernblot结果显示：在二维培养和三维培养下酶消化法和组织块贴壁法提取细胞都检测到Sox2、Nanog、Oct4的蛋白表达，见图5,6。灰度值分析结果显示：在二维培养条件下酶消化法Sox2、Nanog、Oct4的表达均高于组织块贴壁法，差异均有显著性意义。在三维培养条件下组织块贴壁法Sox2的表达高于酶消化法(P<0.01);Nanog、Oct4的表达两种原代分离方法差异无显著性意义。

3、讨论

人脐带间充质干细胞分布于脐带的各个部位，包括羊膜下层、华通氏胶、血管周围区域等[17]，这些细胞表现出自我更新能力、多向分化潜能、旁分泌作用和免疫抑制特性，已在临床上得到了比较广泛的应用[18,19,20,21,22,23]。相关研究表明，间充质干细胞在二维培养下存在体积增大、旁分泌下降、干性表达降低、归巢能力减弱等不足[24]，干细胞在三维球形培养下能克服二维培养的一些局限性，表现出更好的干性表达和分化潜能[25]。采取合适的提取方法和培养方式获得足够数量且具有干性的脐带间充质干细胞是组织工程和细胞治疗面临的一个重要问题。

目前酶消化法和组织块贴壁法是用于分离人脐带间充质干细胞的主要方法。酶消化方法是使用胶原酶或与其他酶组合，在将脐带切成小块且有或没有去除血管的情况下进行。相关研究发现，酶消化法会改变细胞功能，而组织块贴壁方法不使用任何酶，利用脐带间充质干细胞从组织迁移到塑料表面的能力获取细胞[26]。该研究采用这两种方法都能成功分离提取到贴壁生长的脐带间充质干细胞，且酶消化法提取细胞获取的时间比组织块贴壁法短，与HUA等[27]的研究结果一致。在二维培养下组织块贴壁法提取细胞比酶消化法表现出更好的增殖能力，可能是酶消化提取过程中胶原酶的消化及多次离心操作对细胞损伤的影响；三维培养条件下细胞球增殖缓慢，可能是细胞球体中心紧密，内部营养、氧气渗透不足的原因。

免疫表型表达是干细胞重要的生物学标记。研究表明，人脐带间充质干细胞阳性表达CD29、CD44、CD90、CD73、CD105，阴性表达CD34、CD45、CD117、HLA-DR[28,29]。该研究结果显示：在二维培养条件下两种原代分离方法提取的人脐带间充质干细胞均阳性表达CD44、CD90、CD105，阴性表达CD34、CD45，与AUNG等[30]研究结果一致。二维培养下，酶消化法提取细胞CD105的表达高于组织块贴壁法；在三维培养下，酶消化法提取细胞CD90、CD105的表达均高于组织块贴壁法，这可能与酶消化法提取过程中细胞分散、梯度离心、贴壁筛选步骤有关，细胞筛选富集纯度更高使得酶消化法提取细胞无论在二维和三维培养下表达更完整的免疫表型。

转录因子Sox2、Nanog和Oct4通过调节干细胞的基因转录，对多潜能性和自我更新能力起着关键性的调控作用，这3个因子在功能上协作，以促进多能性相关基因的表达和分化相关基因的抑制[31,32]。Sox2对胚胎发育至关重要，并且在维持胚胎细胞和各种成体干细胞的干性中起着重要的作用，其在早期胚胎发育过程中缺乏会导致胚胎致死性[33]。Nanog是干细胞具有发育成各种类型细胞能力的“总开关”，参与人类发育和癌症发生，调节胚胎和胎儿的发育，与细胞分化的方向、增殖和凋亡有关[34]。Oct4是多能胚胎状态的“守门人”，在涉及体细胞重编程的转录因子中起节点作用，是一个重要的母源性因子，其在植入前早期胚胎的母体向合子过渡期间，指导着早期的细胞分裂[35]。该研究结果显示：在二维和三维培养下，两种分离方法提取的人脐带间充质干细胞都能检测到Sox2、Nanog、Oct4的表达，这与BEERAVOLU等[36]的结果一致。在二维培养下，酶消化法提取细胞中3个多能性转录因子的表达均高于组织块贴壁法；在三维培养下，组织块贴壁法提取细胞中Sox2的表达高于酶消化法，Nanog、Oct4的表达两种提取方法间无差异。该研究显示二维培养下酶消化法提取细胞多能性转录因子的表达比组织块贴壁法更好，同时HUANG等[37]研究表明三维培养可以促进多能性转录因子的表达，三维培养下趋势的逆转可能与此相关。

综上所述，在二维和三维培养条件下比较酶消化法和组织块贴壁法提取的人脐带间充质干细胞的生物学特性，从细胞获取时间、细胞增殖、免疫表型、多能性转录因子方面进行进一步比较。研究发现酶消化法细胞获取时间更短，在二维培养下组织块贴壁法提取细胞的增殖能力优于酶消化法，而酶消化法提取细胞免疫表型、多能性转录因子的表达均优于组织块贴壁法；在三维培养下酶消化法提取细胞免疫表型的表达优于组织块贴壁法，但组织块贴壁法提取细胞多能性转录因子的表达优于酶消化法。该研究为选择合适的人脐带间充质干细胞提取方法及培养方式提供了一定的指导意义。

参考文献:

[14]王菲,周洪,郭昱成,等.原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究[J].中国组织工程研究,2014,18(19):3042-3047.

文章来源：陈思铭,胡加伟,李丽丽,伍永强,彭维杰.两种方法提取人脐带间充质干细胞三维培养生物学特性的比较[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3141-3147.