内皮祖细胞(EPCs)是一类能够进行自我更新，具有游走特性并能增殖分化为内皮细胞的定向干细胞[1]。ASAHARA等[2]通过免疫磁珠细胞分选法于1997年首次从人外周血成功分离培养出内皮祖细胞后，越来越多的研究表明，内皮祖细胞在骨髓中占比丰富，且增殖活力强[3,4,5]；在缺血、缺氧、炎症等病理或生理性因素影响下，内皮祖细胞可通过血液循环定向迁移至受损血管与缺血组织，从而对血管内膜进行修复。随着对内皮祖细胞研究的不断深入，利用体外扩增培养的自体内皮祖细胞移植修复损伤内皮已成为防治缺血性心血管疾病的新策略之一[6]，自体细胞移植可有效避免免疫排斥反应，也不存在伦理学方面的争议。然而，缺血性心血管疾病多发于中老年人群，取自中老年机体的内皮祖细胞在体外扩增培养会很快出现增殖缓慢或停滞、分化功能减退等衰老迹象[7]。

衰老的内皮祖细胞数量和功能上明显不如正常的细胞，同时老化内皮祖细胞的修复能力也很难发挥。研究表明，DNA损伤与细胞衰老关系密切，其中ATM与Rad相关蛋白激酶(ATMandRad3-relatedkinase,ATR)依赖的DNA损伤检测点是调控DNA损伤的重要关卡之一[8,9]。前期研究观察到衰老大鼠骨髓源内皮祖细胞在体外培养过程中ATR表达逐渐增高，而抗衰老中药黄精可通过下调ATR表达来延缓内皮祖细胞的衰老[10]，但ATR对内皮祖细胞衰老的影响尚不明确，为此，该研究首先分离培养衰老大鼠骨髓中内皮祖细胞并进行鉴定，再利用慢病毒RNA干扰细胞中ATR基因的表达，进一步探讨ATR基因在内皮祖细胞衰老进程中的作用，以期为临床内皮祖细胞移植提供一些新思路。

1、材料和方法

1.1 设计

体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验。

1.2 时间及地点

实验于2019年12月至2020年12月在贵州医科大学基础医学院药理学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

SD大鼠20只，20月龄，健康SPF级，雌雄各半，体质量500-560g；北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号11400700111130。环境：湿度控制在50%-70%，温度20-26℃，喂养灭菌饮用水和标准鼠饲料。

1.3.2 实验试剂与仪器

M199培养基(批号：2177684)购自Gibco公司；胎牛血清(批号：2139378CP)购自Gibco公司；大鼠骨髓淋巴细胞分离液试剂盒(批号：TBD2013LR)购自天津灏洋生物科技有限公司；碱性成纤维细胞生长因子(批号：1210432-1)、血管内皮生长因子(批号：1107436)购自PeproTech公司；FITC标记的荆豆凝集素1(FITC-UEA-1，批号：055M4077V)购自美国Sigma公司；Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL，批号：YB-0013)购自广州奕源生物科技有限公司；慢病毒及转染试剂购自SantaCruze公司；荧光定量PCR试剂盒购自Servicebio公司；ATR抗体(批号：13934S)购自美国CST公司；β-半糖苷酶染色试剂盒购自碧云天公司；Transwell小室(批号：07417006)购自Corning公司；多聚甲醛溶液(批号：1116A20)购自LEAGENE公司；体外血管生成试剂盒购自Millipore公司；细胞周期检测试剂盒购自碧云天公司。实时荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司；高速离心机购自美国ThermoFisher公司；IX71荧光显微镜购自日本Olympus公司；TS100倒置显微镜购自日本Nikon公司；流式细胞仪购自美国BD公司；酶标仪购自美国ThermoFisher公司；CO2培养箱购自美国ThermoFisher公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓源内皮祖细胞的培养及鉴定[11,12,13]

采用脱颈法处死大鼠，在无菌环境下解剖取出双侧胫骨、股骨，浸泡于体积分数为75%乙醇中消毒，用注射器吸取PBS冲洗髓腔，并运用200目细胞筛将悬液进行过滤，采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，收集细胞后再用PBS进行清洗，获得的细胞团块用含10mg/L血管内皮生长因子、10mg/L碱性成纤维细胞生长因子、体积分数为20%胎牛血清的M199全培养液进行重悬，然后将其接种于T25细胞培养瓶中，于第4天进行换液，之后每3d换液1次，并继续培养至第2代，将细胞用FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL共同孵育，最后用双染色法进行鉴定，荧光显微镜下拍照。

1.4.2 细胞分组及转染

将培养至第3代的内皮祖细胞计数后继续培养24h，将其随机分为3组：未转染组(空白组)、阴性对照组、基因敲减组(ATR-RNAi组)。阴性对照组和ATR-RNAi组分别予以慢病毒RNAi及慢病毒ATR-RNAi稳定转染，筛选合适的感染复数感染细胞，加入终质量浓度为5mg/L的Polybrene，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱孵育24h后吸去含病毒的培养液，重新加入M199全培养基，继续培养至第3,6天；通过荧光显微镜观察慢病毒载体中的绿色荧光蛋白，根据细胞中绿色荧光蛋白的表达情况以判定转染效率，转染效率=荧光阳性细胞数/筛选细胞总数×100%。

1.5 主要观察指标

1.5.1 运用qRT-PCR法检测各组细胞中ATRmRNA的表达

收集转染至第3,6天的各组内皮祖细胞，采用Trizol法提取各组细胞总RNA，依据反转录说明书合成单链cDNA，并以cDNA为模版，参照PCR试剂盒说明书进行扩增，以β-actin(150bp)为内参，上游引物序列为：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物序列：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’,ATR(163bp)的上游引物序列为：5’-AACCTGTTTACTTAAATGTGCTGC-3’，下游引物序列：5’-CTGACCTGTAACGCCGACTC-3’，采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中ATRmRNA表达水平。

1.5.2 Westernblot法检测各组内皮祖细胞中ATR蛋白表达水平

将转染至第3,6天的各组内皮祖细胞从培养箱拿出放于冰盒上，弃去原培养液，PBS预冷，清洗2次，吸净PBS，加入RIPA裂解液，细胞刮刮取细胞，离心，提取细胞总蛋白。根据BCA蛋白定量检测试剂盒说明检测总蛋白浓度，然后按比例将蛋白样品与上样缓冲液混匀；将蛋白样品热变性后加入事先制好的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，然后用PVDF膜进行转移；使用QuickWestern封闭液将膜封闭15min；用TBST液清洗PVDF膜，每次10min，共3次，加入特异性的一抗(ATR抗体、β-actin抗体)，4℃环境慢摇过夜；次日用TBST液洗3次，每次10min，加入二抗，室温下孵育2h;TBST液洗3次，用化学显影液进行曝光，得到目的条带显影；通过ImageJ软件对各个条带的灰度值进行比对分析。

1.5.3 β-半乳糖苷酶染色检测各组内皮祖细胞的衰老情况

依据衰老相关半乳糖苷酶染色试剂盒的说明进行操作，首先从培养箱取出转染至第3,6天的各组内皮祖细胞，弃去原培养基，PBS清洗3次，加入1mL半乳糖苷酶染色固定液，常温下放置15min，弃去固定液，PBS清洗3次，加入事先预热的1mL染色工作液，以防液体蒸发，孔板用封口膜封住，放于无CO2培养箱37℃环境中孵育过夜，次日弃去染色工作液，PBS清洗，在倒置显微镜下观察，随机选取5个视野(×100)拍照，衰老细胞的胞质着色，最后计算出衰老细胞所占的百分比。

1.5.4 MTT比色法检测各组内皮祖细胞的增殖能力

将转染至第3,6天的各组内皮祖细胞接种于96孔板中(2×103个/孔)，37℃培养箱中贴壁培养24h，每孔中加入5g/LMTT溶液15μL，再于培养箱继续孵育4h；拿出孔板弃去上清，加入二甲基亚砜，摇床轻摇10min，置酶标仪在570nm波长处检测吸光度值。

1.5.5 Transwell实验检测各组内皮祖细胞迁移能力

转染至第3,6天的各组内皮祖细胞用胰酶消化后，重悬计数，每孔200μL细胞悬液(1×108L-1)加入Transwell的上室，在下室中加入600μL含50mg/L血管内皮生长因子的M199培养基，于培养箱中培养24h，弃去小室中的培养基，使用多聚甲醛固定20min,PBS清洗2次，放于滤纸上风干，在小室中加入结晶紫染色20min,PBS洗2次，于镜下随机选取5个视野(×100)，将迁移至小室外层的细胞进行计数，取其平均值。

1.5.6 成血管实验检测各组内皮祖细胞成管功能[14]

根据体外血管生成试剂盒说明书操作，ECM10×稀释液和ECMatfixTM胶液同时置于4℃环境过夜融化，次日将100μLECM10×稀释液加入900μLECM-atfixTM胶液中，将二者混匀，以每孔50μL快速加入96孔板中，勿产生气泡，将其放于37℃培养箱，1h后基质胶凝固，将转染至第3,6天的各组内皮祖细胞计数后以150μL(1×105个/孔)的量接种于胶上，37℃环境孵育4h，于镜下随机取5个视野进行观察(×100)，将长度为宽度4倍以上的细胞进行计数，得出平均值。

1.5.7 流式细胞术检测细胞周期

将转染至第3,6天的各组9-1内皮祖细胞用胰酶消化后，以1×109L-1的细胞浓度加入提前预冷的1mL体积分数为70%乙醇中，二者混合后固定12h，离心，用1mL预冷的PBS进行重悬，再次离心，弃上清，余50μLPBS，轻弹管底部以免细胞成团，再用碘化丙啶染色液0.5mL在37℃环境中孵育30min，注意避光，于激发波长488nm处检测红色荧光，24h内完成检测。

1.6 统计学分析

相关数据用表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，方差齐性条件下，采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 大鼠骨髓源内皮祖细胞的生长特性及鉴定结果

提取的大鼠骨髓源单个核细胞在分离之初时呈小圆形，在培养液中呈悬浮状态，3d后细胞大量贴壁，培养5d后贴壁细胞逐渐增多变大，开始出现伪足样突起，呈长梭形首尾相连形成条索样，培养7d后呈纺锤形、铺路石状，培养14d后可见长梭形细胞大量增殖融合，或呈网状结构，见图1A；传代培养至第2代时，细胞经FITC-UEA-1和Dil-ac-LDL处理后，通过荧光显微镜观察内皮祖细胞摄取Dil-ac-LDL呈红色，结合FITC-UEA-1呈绿色，双染色阳性细胞呈橙黄色，为正在分化的内皮祖细胞，见图1B。

2.2 慢病毒在内皮祖细胞中的转染效率

慢病毒转染至第3,6天，阴性对照组和ATR-RNAi组发出绿色荧光的细胞约占观察视野下细胞总数的80%以上，且细胞状态良好，表明转染效率稳定，可进行进一步实验，见图2。

2.3 慢病毒转染后细胞ATRmRNA和蛋白的表达

qRT-PCR与Westernblot结果显示，与未转染组比较，ATR-RNAi组ATRmRNA及蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)，阴性对照组无明显变化；与第3天比较，第6天未转染组和阴性对照组的ATR蛋白表达显著上调(P<0.01),ATRmRNA表达则无明显变化，见图3。

2.4 内皮祖细胞衰老程度的变化

β-半乳糖苷酶染色结果显示，与未转染组比较，ATR-RNAi组的细胞染色阳性率显著降低(P<0.01)，阴性对照组无明显变化；与转染第3天的各组细胞比较，转染第6天的各组细胞染色阳性率均有显著升高(P<0.01)，提示敲减ATR基因可延缓内皮祖细胞衰老，见图4。

2.5 内皮祖细胞功能的变化

MTT、Transwell和成血管实验结果显示，在慢病毒转染第3天和第6天对应时间点里，与未转染组比较，ATR-RNAi组内皮祖细胞的增殖能力有所增强，迁移细胞数量增多，培养4h后镜下可见内皮祖细胞的小管样结构也明显增多(P<0.05)，阴性对照组无明显变化；与转染第3天比较，各组细胞在转染第6天时其增殖、迁移和成血管功能均有所降低(P<0.05)，提示敲减ATR基因可增强内皮祖细胞的功能，见图5。

2.6 内皮祖细胞周期的变化

流式细胞术检测结果表明，与未转染组比较，ATR-RNAi组在第3天其G1期细胞百分率显著降低(P<0.05)，第6天G2期细胞百分率显著降低(P<0.05)，同时其S期的细胞百分率显著增加(P<0.05)，阴性对照组则无显著变化。与第3天比较，未转染组与阴性对照组在第6天时处于G2期的细胞百分率显著升高(P<0.01)，处于S期的细胞百分率显著降低(P<0.05),ATR-RNAi组则无显著变化，见图6。

3、讨论

血管内皮损伤会影响血管屏障功能、血管舒张反应的调节功能及分泌功能等，因此，维护血管内皮的完整性对防治心脑血管疾病具有重要意义[15,16,17]。由于成熟的内皮细胞其增殖能力较低，又属于终末分化细胞，替代损伤内皮能力有限，而内皮祖细胞则可通过旁分泌和自分泌一些细胞因子，促进血管再生、抑制内膜过度增生；研究发现移植体外培养的内皮祖细胞能够在缺血区聚集并参与心肌血管新生[18]，维持心脏、血管功能。近年来利用内皮祖细胞治疗缺血性心血管疾病已成为再生医学研究的热点之一，但是内皮祖细胞在体内数量较少，需通过体外扩增才能满足移植需求；同时由于缺血性疾病多在中老年人群高发，其内皮祖细胞在体外扩增时往往出现细胞复制时间延长、停滞等衰老迹象[19,20]，这极大限制了其临床应用，为此寻找干预内皮祖细胞衰老的分子靶点显得格外重要。

细胞衰老是指细胞的增殖能力丧失并且细胞周期永久停滞，从而进入相对稳定的一种状态。细胞衰老的类型主要包括复制性衰老以及应激引起的早熟性衰老，其中心环节都与细胞DNA损伤有关[21]，研究表明细胞衰老与线粒体DNA损伤、端粒DNA损伤、基因组不稳定以及衰老相关异染色质位点关系密切[22,23]。真核细胞具有一套高度保守的DNA修复机制，通过启动DNA损伤修复反应，可以引发细胞周期阻滞，赢得修复受损DNA的时间，以免受损的DNA信息传递下去，而细胞周期过度阻滞会引起细胞增殖不可逆地停滞从而最终导致细胞衰老[24]。细胞周期DNA损伤检测点是维持细胞基因组遗传信息稳定的重要机制，在DNA损伤修复中发挥着重要作用，其中ATR作为检测点的中心成员主要参与单链DNA损伤或复制叉停止的应答[25,26]。DNA损伤发生后，ATR募集到损伤位点并被激活，导致一系列级联反应，产生的最终效应包括DNA损伤修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡。然而当ATR发生突变或被异常激活时会导致细胞周期检测点失调，进而影响基因组的稳定性，使细胞周期过度阻滞而难以进入S期，从而促使细胞衰老。在作者前期的研究中也发现衰老大鼠内皮祖细胞在体外传代培养中ATR表达逐渐增高，而抗衰老中药黄精在延缓内皮祖细胞衰老的同时也下调了ATR的表达。

该研究通过慢病毒转染使内皮祖细胞中的ATR表达下调，转染第3,6天通过β-半乳糖苷酶染色、MTT法、Transwell实验、成血管实验、流式细胞术检测表明ATR基因在内皮祖细胞衰老中同样发挥了重要作用，敲减ATR基因能减轻细胞周期停滞，延缓内皮祖细胞的衰老，增强内皮祖细胞的功能，这提示延缓内皮祖细胞衰老可通过调控ATR基因来达成。同时，其他研究还表明ATR对于肿瘤细胞的存活也起重要作用[27]，肿瘤细胞更加依赖ATR分子通路调控细胞DNA损伤修复促进细胞存活，抑制ATR可诱导ATR通路依赖型恶性肿瘤细胞死亡，但对正常细胞繁殖和生长影响较小。因此，在抗衰老和抑制肿瘤方面，ATR是一个值得期待和关注的靶点。

该研究在干细胞衰老领域探讨了DNA损伤检测点ATR基因对内皮祖细胞衰老的干预作用，可为临床内皮祖细胞移植提供一些新思路，但由于实验的局限性，只进行了体外实验，并未通过体内实验进行验证，探索还未十分深入和广泛，尚待后续研究。

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文章来源：唐蜜,秦臻,韦正新,倪鸣,柴小康.敲减ATR基因对大鼠骨髓内皮祖细胞衰老及其功能的影响[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3129-3134.