近几年，心血管疾病仍然是社会高度关注的问题之一。尽管目前采取疾病预防和综合治疗措施包括药物治疗、介入治疗、手术治疗等，但是其死亡率仍然最高。许多研究表明，干细胞分化的心肌样细胞可以代替受损的心肌细胞，从而改善心脏功能，解决了心肌梗死后心肌损伤、细胞凋亡和不能再生的问题，骨髓间充质干细胞在组织工程研究中被认为是最为理想的种子细胞[1]，但是如何在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞高效率分化一直是研究的热点。5-氮胞苷是诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的有效化学制剂[2]，由于5-氮胞苷在临床可用作抗癌药物治疗急性骨髓性白血病，所以单独诱导具有一定的细胞毒性。骨形态发生蛋白2对于细胞生长、分化和凋亡具有一定的作用[3]。该研究用骨形态发生蛋白2与5-氮胞苷联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，从形态学、蛋白以及基因等多方面表明分化效率明显提高，说明二者联合诱导是一种更有效的体外诱导方法，既可以减少单个诱导剂的局限性，又可以增加体外诱导分化为心肌样细胞的效率，现报道如下。

1、材料和方法

1.1 设计

细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点

实验于2019年6月至2020年11月在河北北方学院生命科学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

SPF级SD大鼠6只，3周龄，雌雄不限，体质量25-35g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-001。

1.3.2 实验试剂和仪器

IMDM培养基(美国CORNING公司)；胎牛血清(德国PAN-BiotechGmbH公司)；二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差荧光显微镜(日本Nikon公司)；普通光学显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；超净工作台(苏州净化集团安泰公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

采用全骨髓培养贴壁法获取骨髓间充质干细胞。将大鼠脱臼处死，放入体积分数75%乙醇中浸泡5min，超净台中分离肱骨和胫骨，暴露骨髓腔，用IMDM完全培养基冲出骨髓，收集在无菌离心管中，室温离心(1500r/min,8min)，弃上清，用适量的IMDM完全培养基将细胞重悬，接种到无菌培养瓶，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱，48h后首次换液，之后每隔3d换液1次，培养至2-4代用于以下实验。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定

选择融合度达到80%-90%长势良好的细胞，PBS冲洗3次，加入1.0-2.0mL胰酶消化，新鲜IMDM培养基终止消化后反复吹打成单细胞悬液，室温离心(1500r/min,7min)，弃上清，加入PBS振荡重悬，离心，重复3次，制成单细胞悬液，每个样品分装到3个离心管，实验管中加入CD29-PE抗体、CD45-FITC抗体、CD90-PE-CyTM7抗体混匀，同型对照管中加入CD29-PE、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM7同型对照抗体混匀，阴性对照管中只加入适量的PBS混匀，在4℃条件下孵育30min，离心弃上清，再加入适量PBS，离心弃上清，再加入适量的PBS，上机进行流式细胞技术检测。

1.4.3 大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化

将长势良好、形态均一的第1代骨髓间充质干细胞，以1×108L-1细胞浓度进行传代，37℃，体积分数为5%CO2培养箱孵育过夜。第2代细胞培养48h后，细胞融合密度约达80%，将其分为4组：(1)空白对照组：只加入IMDM完全培养基；(2)骨形态发生蛋白2组：在培养基中加入5mL终质量浓度为200ng/L骨形态发生蛋白2诱导72h;(3)5-氮胞苷组：在培养基中加入5mL终浓度为10μmol/L5-氮胞苷诱导24h;(4)5-氮胞苷+骨形态发生蛋白2组：在培养基中加入5mL终浓度为10μmol/L5-氮胞苷的培养基预先处理24h后，更换成5mL终质量浓度为200ng/L骨形态发生蛋白2诱导72h。各组诱导完成后更换成IMDM完全培养基继续培养，每3d换液1次，培养至28d，在显微镜下观察各组细胞形态变化以及生长状况。

1.4.4 免疫细胞化学法检测cTnI的表达

诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，将细胞浓度调整为1×108L-1，接种于24孔板中(接种前放置细胞爬片)，每孔500μL，培养24h后待细胞融合度达到80%-90%时，PBS冲洗，40g/L多聚甲醛-0.1mol/L磷酸盐缓冲液固定30min，弃掉固定液，PBS冲洗，1%TritonX-100-PBS室温下通透20min,PBS冲洗，滴加适量的内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育15min,PBS冲洗，滴加适量的封闭用正常山羊血清工作液37℃孵育15min，用滤纸吸干液体(勿洗)，滴加cTnI一抗(1∶50)4℃湿盒孵育过夜，复温30min,PBS冲洗，滴加适量的生物素标记的羊抗兔IgG室温孵育20min,PBS冲洗，滴加适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育15min,PBS冲洗，加入适量的新鲜配制的二氨基联苯胺显色液，根据染色程度终止染色，自来水冲洗后进行苏木精复染20s，然后依次进行分化、返蓝、脱水、透明、封固，光学显微镜下观察。

1.4.5 免疫荧光化学法检测cTnT、Desmin的表达

诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，将细胞浓度调整为1×108L-1，接种于24孔板中(接种前放置细胞爬片)，培养24h后待细胞融合度达到80%-90%时，PBS冲洗，40g/L多聚甲醛-0.1mol/L磷酸盐缓冲液固定30min，弃掉固定液，PBS冲洗，1%TritonX-100-PBS室温通透20min,PBS冲洗，滴加适量的封闭用正常山羊血清工作液室温封闭30min，用滤纸吸干液体(勿洗)，滴加cTnT、Desmin一抗(1∶50)4℃湿盒孵育过夜，复温30min,PBST冲洗3min×3次，滴加荧光素标记的羊抗兔IgG(1∶300),37℃孵育60min,PBS冲洗，吸干，用抗荧光衰减封固剂进行封固，倒置荧光显微镜下观察。

1.4.6 Westernblot检测cTnT、cTnI的表达

诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，弃掉原培养基，PBS冲洗，用细胞刮勺刮下细胞，收集到离心管，常温离心(1500r/min,7min)，弃上清，按每5×105个细胞加入200μL预冷的裂解液(每1mLRIPA裂解液中加入5μL蛋白酶抑制剂)，混匀，4℃振荡离心(12000r/min)15min，取上清，放入新的预冷的离心管，检测蛋白浓度，将蛋白样品以1∶5的比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，充分混匀，在进行下一步实验前，将配制好的蛋白样品在沸水中加热10min进行变性，在凝胶样品孔内加入已变性的蛋白样品和蛋白marker，电压设置160V，时间45min左右，电泳停止后取出凝胶玻璃板进行剥胶，在电压100V，时间60min条件下完成转膜(Trans-BlotTurbo全能型蛋白转印系统)，配制好封闭液后将膜封闭2h，加入一抗(Actin以1∶10000稀释；cTnT,cTnI均以1∶1000稀释)4℃孵育过夜，洗膜，加入二抗稀释液[辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，以1∶1000稀释]，室温孵育2h，室温脱色摇床上洗膜，加入ECL化学发光工作液，采用AI600超灵敏化学发光成像仪成像，根据得到的条带对实验结果进行定量分析。

1.4.7 RT-qPCR法检测GATA-4、Nkx2.5mRNA表达

诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，提取各组细胞的总RNA，以GAPDH作为内参对照，按照ABScriptllRTMasterMixforqPCR试剂说明及条件将其反转录为cDNA，按照2XUniversalSYBRGreenFastqPCRMix试剂说明进行目的基因GATA-4、Nkx2.5的扩增，分析数据。各基因引物的合成序列，见表1。

1.5 主要观察指标

(1)骨髓间充质干细胞的形态及表面抗原鉴定；(2)各组骨髓间充质干细胞诱导分化后的形态变化；(3)各组骨髓间充质干细胞诱导分化后cTnI、cTnT、Desmin蛋白表达以及GATA-4、Nkx2.5mRNA表达。

1.6 统计学分析

使用SPSS20.0统计学软件处理实验数据，计量资料用表示，利用t检验进行两组间比较，单因素方差分析进行多组间比较，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 骨髓间充质干细胞形态

倒置相差显微镜下观察，分离初期大鼠骨髓悬液细胞密集，细胞均为圆形，形态均一；12h开始贴壁，24h换液弃除未贴壁细胞；3d后可见细胞伸出突起，突起圆顿光滑，细胞呈梭形、多边形和菱形，部分外观似纤维细胞样并且数量明显增加；4d开始呈对数增长；7d左右细胞长满瓶底，体积增大，形态多样化；传至第4代细胞形态均一，排列整齐，细胞之间紧密联系；5-氮胞苷和骨形态发生蛋白2诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，细胞中出现类肌管样结构，未见自发搏动，见图1。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的表面抗原鉴定结果

流式细胞术检测骨髓间充质干细胞的表面抗原CD29、CD45和CD90阳性表达率分别是93.6%,1.9%,95.3%，说明全骨髓贴壁法分离的细胞为纯化的骨髓间充质干细胞，见图2。

2.3 免疫细胞化学法和免疫荧光细胞化学法检测结果

免疫荧光细胞化学法检测结果：诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，各诱导组心肌样细胞cTnT蛋白和Desmin蛋白表达均增加，其中5-氮胞苷+骨形态发生蛋白2联合诱导组的cTnT蛋白和Desmin蛋白表达量显著高于单独诱导组。免疫细胞化学法检测结果：诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，细胞质呈棕黄色，其中5-氮胞苷+骨形态发生蛋白2联合诱导组的cTnI蛋白表达量显著高于单独诱导组，见图3。

2.4 Westernblot检测结果

骨髓间充质干细胞诱导3d后更换正常培养基继续培养4周，各组cTnT、cTnI蛋白表达量均增加，其中5-氮胞苷组+骨形态发生蛋白2组cTnT、cTnI蛋白表达量显著高于单独诱导组，见图4,5和表2。

2.5 RT-qPCR检测结果

骨髓间充质干细胞诱导3d后更换正常培养基继续培养1,2,4周，各诱导组均有GATA-4和Nkx2.5的mRNA表达，其中5-氮胞苷+骨形态发生蛋白2组在4周时表达相对较显著，见图6，表3和表4。

2.6 生物相容性

骨髓间充质干细胞是一类易于分离和分泌生物活性分子的多功能细胞，它可以激活组织修复过程，调节免疫和炎症细胞，由于骨髓间充质干细胞缺乏细胞表面组织相容性复合体Ⅱ类分子和T细胞共刺激分子以及旁分泌介导的免疫调节活性，因此其具有免疫特权作用，避免了宿主免疫系统的破坏[4]。骨髓间充质干细胞与心肌细胞尽管来自不同的胚胎区域，但是均来自于早期中胚层，在作用上具有一定的相似性。目前也有关于自体人间充质干细胞移植和同种异体人间充质干细胞经心内膜移植治疗缺血性心肌病的临床研究，同种异体骨髓间充质干细胞在心肌梗死患者中具有良好的耐受性[5]。为了提高心脏的再生，将细胞与生物材料相结合成为现研究的热点，这样既可以创造相似的微环境又可以具有良好的机械性能，还有生物降解和生物相容性。因此，与生物材料结合的方法可以为受损的心脏提供生物物理性支持[6,7]。

3、讨论

干细胞治疗心肌梗死的方式一般分为两种：(1)将干细胞直接移植到心脏损伤部位，直接在体内诱导干细胞向心肌细胞定向分化[8];(2)体外直接诱导干细胞分化成为心肌样细胞，将分化的心肌细胞移植到损伤部位。骨髓间充质干细胞是一种够从骨髓中分离出来的多能干细胞，它具有多向分化潜力和高度自我更新能力，在一定条件下可以诱导分化为多种功能性细胞，其中包括心肌细胞。研究发现它具有获取容易、操作简单、免疫调节作用，在组织工程领域已经成为治疗心血管疾病的理想种子细胞。

5-氮胞苷作为心源性诱导剂，属于胞嘧啶核苷类似物，可以引起DNA中一些胞嘧啶去甲基化，通常可参与细胞的生长和分化，对提高心肌细胞分化效率具有重要的意义。早在1999年，MAKINO等[9]的研究中就首次证实了5-氮胞苷在体外能够将间充质干细胞成功诱导分化为心肌细胞。由此5-氮胞苷成为公认的细胞化学诱导剂[10,11,12,13]。2004年，CHOI等[14]在研究中发现，5-氮胞苷诱导的胚胎干细胞分化成为心肌样细胞，有心肌标志基因和骨形态发生蛋白信号分子的上调。但是由于5-氮胞苷具有毒性，对细胞具有一定的损伤，做为单独诱导剂具有一定的局限性。

骨形态发生蛋白2属于转化生长因子β家族中的一员，对心脏发育具有一定的作用。在心肌分化的发育水平和细胞水平上，骨形态发生蛋白2其实是一个关键的上游信号。有研究表明，胚胎中骨形态发生蛋白2表达增加可以促进心肌细胞的增殖，并且激活骨形态发生蛋白2可能对未成熟心肌细胞的扩增具有帮助。骨形态发生蛋白2在心肌方面具有多种作用：(1)在心脏的形成和心脏修复的过程中，骨形态发生蛋白2能促进骨髓间充质干细胞旁分泌相关因子[15,16];(2)骨形态发生蛋白2具有抗纤维化的作用。骨形态发生蛋白2可以作为一种新型的抗纤维化细胞因子，在减轻压力超负荷诱导的心肌纤维化方面具有重要作用，可改善心功能[17,18];(3)骨形态发生蛋白2具有一定的抗凋亡作用，骨形态发生蛋白2主要激活PI3K/AKT或MAPK通路；(4)此外，骨形态发生蛋白2是一种促进分化的因子，可以增强骨髓间充质干细胞促心肌修复和再生作用。许多研究证实骨形态发生蛋白2在体外可以诱导骨髓间充质干细胞分化成为心肌样细胞[19,20,21,22]。

骨形态发生蛋白2与5-氮胞苷联合诱导时，骨形态发生蛋白2的多重作用是否在一定程度上对骨髓间充质干细胞存在一定的保护作用，并且在一定程度上可以减轻5-氮胞苷的细胞毒性，从而显著增加心肌样细胞的分化效率。ABBEY等[23]研究表明，在小鼠p19EC细胞分化的初始阶段，5-氮胞苷可以通过降低甲基化和组蛋白乙酰化从而使心脏发生相关基因高表达，激活ERK信号通路，使心脏相关基因骨形态发生蛋白2的DNA甲基化状态发生变化。

实验通过免疫荧光细胞化学法、免疫细胞化学法检测均证实了骨形态发生蛋白2与5-氮胞苷联合诱导组cTnT、Desmin、cTnI的表达均高于单独诱导组，说明诱导后的心肌样细胞具有心肌细胞的表型。cTnT和cTnI属于心肌肌钙蛋白一部分，均可以调节肌肉收缩，并且具有高度的心肌特异性[24,25]。Desmin是一种心肌细胞早期出现的细胞骨架蛋白，对肌细胞收缩具有维持作用，在很早就被认为是心肌细胞分化的标志之一[26,27]。为了进一步证实诱导后的心肌样细胞的有效性，RT-qPCR检测结果显示骨髓间充质干细胞诱导3d后更换正常培养基继续培养1,2,4周具有GATA-4和Nkx2.5mRNA的表达，GATA-4和Nkx2.5均为心脏早期转录因子，二者具有协同作用，参与心脏前体细胞分化的整个过程[28,29]，进一步证明了经过5-氮胞苷与骨形态发生蛋白2联合诱导优于单独诱导。

综上所述，实验采用公认的化学诱导剂5-氮胞苷与心脏相关因子骨形态发生蛋白2联合诱导，从形态学、蛋白以及基因等多方面证实，联合诱导的分化效率要优于单独诱导，但是5-氮胞苷与骨形态发生蛋白2联合诱导通过何种机制促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，还要进一步探究。

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文章来源：王文华,刘洋,王巧敏,吕洋,赵亚如,王海萍.5-氮胞苷联合骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3102-3107.