关节软骨损伤是一种临床常见的骨科疾病，主要由创伤和骨关节炎引起，若不及时修复，不仅会有长期疼痛不适，还会不断进展，最终导致关节软骨退变和继发性骨质增生[1,2,3]。软骨细胞是关节软骨的细胞构成，在维持软骨组织的生理功能中起关键作用[4]，探索关节软骨细胞的损伤修复机制和干预策略在关节软骨损伤修复及临床治疗中具有重要的意义。

虾青素又名虾黄素、虾黄质，是一种含氧的类胡萝卜素，具有显著的抗炎、抗氧化、抗骨质疏松等多种生物活性[5,6]。已有研究表明，虾青素可以有效调控关节软骨细胞代谢，增强细胞活性，延缓凋亡，从而保护关节软骨[7,8]。但是虾青素保护关节软骨细胞的分子机制尚不明确。

环状RNA是一类缺少5’帽子和3’多聚A尾的非编码RNA，以反向剪接的方式形成一个共价闭合的环状架构，在组织和细胞中具有稳定性和保守性的特点[9]。近年来，环状RNA被报道参与包括骨关节炎、骨肉瘤等多种骨科疾病的发生和发展，有可能成为相关骨科疾病的治疗靶点[10,11,12]。环状RNA在虾青素调控的软骨损伤保护中扮演着什么样的角色并不清楚。

此次研究利用叔丁基过氧化氢(tert-butylhydrogenperoxide,tBHP)作为活性氧供体诱导人正常软骨细胞C28/I2损伤，通过检测细胞活力、炎症因子、氧化应激和胞外基质等的变化评价虾青素对tBHP诱导的C28/I2细胞损伤的保护作用，并探讨环状RNAcircHP1BP3在其中的作用机制。

1、材料和方法

1.1 设计

细胞学体外观察实验，数据间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。

1.2 时间及地点

实验于2020年9-12月在南京医科大学第一附属医院完成。

1.3 材料

人正常软骨细胞C28/I2(中国科学院上海细胞库)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；胰酶和青链霉素混合液、二甲基亚砜溶液、细胞凋亡检测试剂盒(索莱宝，中国)；tBHP、虾青素(Sigma，美国)；TRIZOL、Lipofectamine3000转染试剂(Invitrogen，美国)；MTT溶液(APExBIO，美国)；反转录试剂盒(宝日医生物，中国)；SYBRGreen荧光染料法PCR试剂盒(ABI，美国)；白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子αELISA检测试剂盒(酶联生物，中国)；活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶检测试剂盒(碧云天生物，中国)；引物(生工生物工程，中国)；circHP1BP3过表达及对照质粒、circHP1BP3小干扰RNA及其对照小干扰RNA(锐博生物技术，中国)；胞浆胞核分离试剂盒(碧云天生物，中国)；Ⅱ型胶原抗体、蛋白聚糖抗体、基质金属蛋白酶13抗体、β-actin抗体、HRP标记的抗兔IgG(Abcam，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养和药物处理

C28/I2细胞培养于含有体积分数10%胎牛血清和1%青霉素链霉素混合液的DMEM培养液中，置于37℃和体积分数5%CO2的孵箱中常规培养。采用100μmol/L的tBHP进行损伤诱导：将C28/I2细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，待细胞90%融合后，采用tBHP处理细胞24h诱导细胞损伤。虾青素保护实验中，于tBHP诱导前加入20μmol/L虾青素进行预保护处理2h，后加入终浓度为100μmol/L的tBHP，虾青素与tBHP共同处理24h。

1.4.2 MTT法

C28/I2细胞以5×103/孔接种于96孔板中，置于培养箱中培养24h后，按实验需要进行相应的药物处理。每个处理组设3个平行孔。于实验处理结束后，每孔加入20µL的MTT溶液，置于孵箱中继续培养4h。孵育结束后，每孔加入100μL二甲基亚砜溶液震荡10min，采用酶标仪于490nm波长处检测各孔的吸光度值，并计算细胞增殖活性。

1.4.3 细胞凋亡检测

收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次。参照细胞凋亡检测试剂盒说明书，使用400µL的1×BindingBuffer悬浮细胞，调整细胞浓度至大约1×109L-1，加入5µL的AnnexinV-FITC，混匀后避光孵育15min，然后加入5µL的PI，混匀后避光孵育5min。在1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.4 ELISA检测炎症因子

C28/I2细胞于6孔板中按实验需要进行相应的药物处理(见1.4.1)，处理结束后收集上清液，分别使用白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子αELISA检测试剂盒，按试剂盒说明书进行操作，检测培养液中白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。

1.4.5 氧化应激指标检测

细胞经处理后，离心收集细胞，分别使用活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶检测试剂盒，检测细胞中活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶的表达水平，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.6 差异表达环状RNA的筛选及鉴定

收集细胞，TRIZOL提取细胞总RNA，定量后取2µg总RNA进行反转录。反应体系为20µL，反应条件为94℃2min，后94℃30s,60℃30s，共40个循环。反应结束后，以GPADH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达水平。

1.4.7 circHP1BP3特性分析

使用放线菌素D处理细胞0,4,8,12h，另使用RNaseR外切酶处理细胞2h，采用实时荧光定量PCR检测细胞中circHP1BP3和线性HP1BP3的表达。使用胞浆胞核分离试剂盒将细胞核质分离，采用实时荧光定量PCR分别检测细胞核和细胞质中circHP1BP3的表达，以U6为细胞核内参，18SrRNA为细胞质内参，鉴定circHP1BP3在核质中的分布。PCR引物序列见表1。

1.4.8 细胞转染

使用Lipofectamine3000转染试剂进行质粒及小干扰RNA转染，按试剂盒说明书进行操作。转染48h后，采用实时荧光定量PCR检测转染效率。

1.4.9 Westernblot

细胞经处理后，离心收集细胞，使用PBS清洗细胞3次，加入细胞裂解液裂解细胞15min后，离心获得细胞总蛋白。取50µg蛋白样品上样进行SDS-PAGE蛋白电泳，然后转膜，使用10%脱脂奶粉封膜1h,PBS洗3次。然后加一抗稀释液，4℃过夜孵育。洗膜，加酶标二抗，室温反应2h。洗膜，加ECL化学发光液显影，显微镜下曝光并拍照，ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参对照，计算细胞中Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13蛋白相对表达水平。

1.5 主要观察指标

(1)通过细胞活力、凋亡及炎性因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的分泌，氧化应激相关指标活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶、基质金属蛋白酶13的表达，评价tBHP诱导细胞损伤及加入虾青素后的损伤修复情况；(2)circHP1BP3在tBHP诱导及tBHP诱导加虾青素处理细胞中的表达情况；(3)过表达或沉默circHP1BP3对tBHP诱导及tBHP诱导加虾青素处理细胞损伤的影响。

1.6 统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，结果以表示，数据间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，P<0.05表示差异有显著性意义。

2、结果

2.1 tBHP诱导C28/I2细胞损伤

根据文献报道[13]，采用100μmol/LtBHP处理C28/I2细胞24h，可诱导细胞损伤。tBHP诱导处理降低了C28/I2细胞活性，增加了细胞凋亡率，并且促进了炎性因子白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的分泌。同时，tBHP处理导致C28/I2细胞氧化应激相关指标活性氧和丙二醛水平升高，超氧化物歧化酶活性降低。tBHP诱导处理后，C28/I2细胞中胞外基质Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖表达下降，基质金属蛋白酶13表达上升，见图1。这些结果表明，tBHP处理C28/I2细胞可降低细胞增殖活性、诱导细胞凋亡、增加炎症反应、增加氧化应激水平，且促进胞外基质降解，提示100μmol/LtBHP处理24h诱导了C28/I2细胞损伤。

2.2 虾青素对tBHP诱导的C28/I2细胞损伤的影响

根据文献报道[14]，于tBHP诱导前采用20μmol/L虾青素进行预保护处理2h，后将虾青素与tBHP共同处理C28/I2细胞24h。此次研究发现，虾青素处理能够显著改善tBHP诱导对C28/I2细胞活力的抑制作用，降低细胞凋亡比例，减轻细胞的炎症反应、恢复活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶表达水平，增加Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达量，降低基质金属蛋白酶13表达量，见图1。结果提示，虾青素可以显著改善tBHP诱导的C28/I2细胞损伤，对C28/I2细胞损伤起保护作用。

2.3 tBHP对C28/I2细胞环状RNA表达的影响

为了探究参与C28/I2细胞损伤的环状RNA，根据文献报道，选择了与骨关节炎相关的环状RNA进行研究[15]。采用实时荧光定量PCR检测了C28/I2细胞中circEIF4G3、circFANCA、circWBSCR17、circHP1BP3、circRPAP2和circPOLR3C的表达。结果发现tBHP诱导下，细胞中circEIF4G3、circFANCA和circWBSCR17的表达水平显著升高，circHP1BP3、circRPAP2和circPOLR3C的相对表达水平显著下调。而虾青素处理能够显著上调tBHP诱导的细胞中circHP1BP3的表达，对其他环状RNA表达量的影响不显著，见图2A。放线菌素D和RNaseR酶切实验证实，相较于线性HP1BP3,circHP1BP3具有较高的稳定性，见图2B,C。核质定位实验证实，circHP1BP3主要定位于细胞质，见图2D。

2.4 过表达circHP1BP3降低tBHP诱导的C28/I2细胞损伤

为了验证circHP1BP3在tBHP诱导C28/I2细胞损伤中的作用，在C28/I2细胞中转染circHP1BP3过表达载体，实时荧光定量PCR检测发现，过表达载体转染显著升高了C28/I2细胞中circHP1BP3表达量，并且显著恢复了tBHP抑制的C28/I2细胞活力，抑制了tBHP诱导的细胞凋亡，抑制炎性因子白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α分泌增加，抑制活性氧、丙二醛以及基质金属蛋白酶13表达增加，增加了超氧化物歧化酶的活性以及胞外基质蛋白Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，表明在C28/I2细胞中过表达circHP1BP3可以改善tBHP诱导的C28/I2细胞损伤，提示tBHP可能通过降低circHP1BP3诱导C28/I2细胞损伤，见图3。

2.5 虾青素通过circHP1BP3调控tBHP诱导的C28/I2细胞损伤

为了进一步探究circHP1BP3在虾青素改善tBHP诱导的C28/I2细胞损伤中的作用，采用RNA干扰技术，在C28/I2细胞中转染circHP1BP3小干扰RNA，沉默C28/I2细胞中circHP1BP3的表达。通过实时荧光定量PCR检测发现，3组特异性小干扰RNA中的两组(si-circHP1BP3-1和si-circHP1BP3-2)能显著降低C28/I2细胞中的circHP1BP3表达，且si-circHP1BP3-1的沉默效果优于si-circHP1BP3-2，故在后续研究中采用si-circHP1BP3-1进行实验。研究发现，circHP1BP3沉默降低了C28/I2细胞活力，增加了细胞凋亡，促进了炎性因子白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α分泌，增加了活性氧、丙二醛和基质金属蛋白酶13表达，下调了超氧化物歧化酶的活性和Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的表达，表明circHP1BP3沉默抑制了虾青素对tBHP诱导C28/I2细胞损伤的保护作用，提示虾青素可能通过影响circHP1BP3调控tBHP诱导的C28/I2细胞损伤，见图4。

3、讨论

关节软骨损伤是临床上的常见疾病，探索关节损伤修复的机制和治疗方法具有重要的临床意义。研究表明，虾青素可以调节关节软骨功能，对软骨具有保护作用[7,8]，但对正常培养的软骨细胞活力影响并不显著[16]。此次研究采用tBHP诱导人正常软骨细胞C28/I2损伤，研究发现，虾青素处理可以恢复tBHP诱导的细胞活力下降，抑制tBHP诱导的细胞凋亡、炎症反应、氧化应激反应和胞外基质降解。tBHP通过circHP1BP3诱导C28/I2细胞损伤，虾青素处理可以恢复tBHP引起的circHP1BP3表达下调。并且在tBHP诱导的C28/I2细胞中通过小干扰RNA沉默circHP1BP3，虾青素对tBHP诱导C28/I2细胞损伤的保护作用也受到抑制。研究结果表明，tBHP通过下调circHP1BP3诱导C28/I2细胞损伤，虾青素可以通过恢复circHP1BP3的表达抑制tBHP诱导的细胞损伤，对软骨细胞起到保护作用。

氧化应激是骨关节炎发病的重要机制，引起软骨细胞凋亡和炎症，影响胞外基质合成/降解，导致软骨退化[17]。tBHP是一种烷基氢有机过氧化物，可作为活性氧供体诱导细胞损伤[13]。此次研究根据文献报道[13]，采用100μmol/L浓度的tBHP诱导C28/I2细胞，构建软骨细胞损伤模型。tBHP处理后，C28/I2细胞活力下降，凋亡增加，炎症反应和氧化应激增强，胞外基质降解增加，与文献报道的结果相似，符合软骨细胞损伤的基本特征[18]。超氧化物歧化酶是生物体内抗氧化酶系的重要成员之一，其主要功能是清除体内超氧阴离子和参与活性氧自由基代谢[19]。骨关节炎进展过程中存在超氧化物歧化酶的损伤，超氧化物歧化酶基因表达可在多种因子的调控下对不同水平的氧化还原状态做出响应，进而参与维持机体细胞和整体水平的氧化还原稳态，在骨关节炎发生和进展中具有重要作用[20,21]。

此次研究发现，虾青素处理可以改善tBHP导致的氧化应激反应，降低活性氧和丙二醛表达，上调超氧化物歧化酶活性，提示虾青素在C28/I2细胞中具有抗氧化作用，与文献报道一致[5,6]，提示虾青素可能通过调节tBHP诱导的氧化应激，对C28/I2细胞起保护作用。除了对软骨细胞氧化应激的调节作用外，虾青素还被报道可以通过调节基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13来抑制关节软骨的降解[22]。此次研究中也发现，虾青素可以缓和tBHP对C28/I2细胞中基质金属蛋白酶13表达的促进作用，下调基质金属蛋白酶13表达，与文献报道结果一致。

近年来，非编码RNA，如微小RNA、长链非编码RNA和环状RNA等在骨关节炎发病中的作用越来越受到重视和关注[23]。随着人们对环状RNA研究的深入，越来越多的证据显示，损伤的关节软骨中环状RNA的表达特征与正常软骨组织存在较大差异，提示环状RNA参与调节关节损伤。一些环状RNA被报道与软骨细胞增殖、凋亡、炎症和胞外基质降解相关[24]。WANG等[25]通过环状RNA芯片研究了大骨病和骨关节炎中环状RNA表达的差异，提出患者外周血中hsa＿circ＿0020014＿CBC1表达量可以作为临床上区分骨关节炎和大骨病的标志。这一结果也提示，环状RNA具有作为临床上骨关节炎诊断标志物的潜力。随着研究的深入，多种环状RNA分子在骨关节炎发病中的作用机制也相继被报道。SHEN等[26]的研究表明，骨关节炎中circSERPINE2表达下降，过表达circSERPINE可以通过靶向miR-1271降低软骨细胞凋亡和胞外基质降解。CircRNA-UBE2G1通过miR-373/HIF-1a途径促进脂多糖诱导的骨关节炎进展[27],circPSM3则可以通过靶向miRNA-296-5p抑制骨关节炎软骨细胞增殖和分化[28]。

根据文献报道的环状RNAMicroarray结果[15]，作者挑选了表达与骨关节炎相关的却少有相关功能报道的6个环状RNA进行后续研究，包括在骨关节炎中表达上调的circEIF4G3、circFANCA和circWBSCR17，以及表达下调的circHP1BP3、circRPAP2和circPOLR3C。此次研究发现，tBHP诱导C28/I2细胞损伤后，6种环状RNA的表达变化特征与文献报道类似[15]。但在虾青素处理后，仅有circHP1BP3表达发生了变化：tBHP显著下调circHP1BP3表达，虾青素能够恢复circHP1BP3的表达。circHP1BP3过表达实验和RNA干扰实验进一步证明，虾青素通过调节circHP1BP3表达对tBHP诱导的C28/I2细胞损伤起保护作用。关于circHP1BP3在软骨损伤和修复中的功能此前在国内外鲜有报道，此文首次报道了circHP1BP3在虾青素调控关节软骨细胞损伤中的作用。

微小RNA作为转录后调控的关键因子，可通过碱基互补配对结合到互补的mRNA位点上，微小RNA的改变会调控mRNA和蛋白的表达[17]。环状RNA是一种含有丰富微小RNA反应元件的竞争性内源RNA分子，具有微小RNA海绵作用[29,30]。竞争性内源RNA的出现和缺失可通过与具有互补序列的靶微小RNA结合，影响微小RNA功能活性从而调节基因的表达[31]。此次研究虽然证明虾青素能够通过调节circHP1BP3的表达对tBHP诱导C28/I2细胞损伤起损伤保护作用，但circHP1BP3的下游靶向微小RNA还不清楚，值得后续深入探究。

综上所述，此次研究证明了circHP1BP3参与调节虾青素对tBHP诱导的C28/I2细胞的损伤保护作用。研究结果为虾青素在骨关节炎和软骨损伤治疗中的应用提供了实验证据，也为探索虾青素抗氧化作用的环状RNA机制奠定了理论基础。

文章来源：朱春晖,张宜,宋黄鹤,梁文卫.虾青素对叔丁基过氧化氢诱导软骨细胞损伤的保护作用[J].中国组织工程研究,2022,26(11):1648-1655.