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不同离心参数对口蹄疫病毒有效抗原成分回收率的影响

2024-03-04 13 上传者：管理员

摘要：为了减少在疫苗生产中口蹄疫病毒液及有效成分的损失，试验通过加装在线浊度仪，测试不同离心参数对病毒离心的效果。结果：排渣时间设定为20 min,排渣浊度在50 NTU时病毒颗粒(146S)的回收率最高，可降低生产成本，提高原辅材料的利用率。

关键词：
FMDV
口蹄疫病毒
抗原回收
疫苗生产
离心参数
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口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病，完整的病毒粒子(146S)是口蹄疫疫苗有效成分的重要组成部分，其含量直接决定疫苗的质量[1]。目前中国兽医药品监察所出具的兽用生物制品生产与检验报告已将146S列为必检项目，作为评价疫苗质量最重要的参数之一，并逐步替代PD50值检测，这对实际生产具有重要的指导意义。完整的病毒颗粒是疫苗的主要成分，其完整性对于疫苗效力至关重要，能够更好地模拟天然病毒，从而激发更强的免疫反应。实验研究表明，完整的病毒颗粒能够更有效地刺激机体产生中和抗体和细胞免疫，从而提高疫苗的保护效果。如果病毒颗粒的完整性受损，其免疫原性将会降低，导致疫苗效力下降。相关实验表明，离心浊度和次数对病毒颗粒回收具有显著影响：在一定范围内，随着离心浊度增加和排渣次数减少，病毒颗粒的回收率提高。然而过高的离心浊度则会直接影响后续的灭活和浓缩纯化。此外，过度频繁排渣会造成合格料液及完整病毒颗粒大量浪费，导致回收率下降。在口蹄疫免疫中，能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的主要是完整病毒颗粒抗原，该抗原基本含有口蹄疫病毒所有的中和位点，是口蹄疫病毒主要的有效抗原成分[2]。本试验通过对离心机设置不同的离心参数对口蹄疫病毒有效抗原成分回收率进行检测，为疫苗生产提供参考。

1、材料与方法

1.1 主要材料

口蹄疫(Re-A/WH/09株)病毒液(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、146S检测试剂盒(赛诺利康生物技术有限公司)。

1.2 主要仪器

高速连续流离心机[型号：BTPX710,阿法拉伐(上海)有限公司]、在线浊度仪[型号：CONTROL 4000,奥普士乐利(中国)有限公司]、便携式浊度仪(型号：HACH 2100Q,美国哈希公司)、紫外分光光度计(型号：X-6,上海元析仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 离心机完整性测试

在试验前1天用纯化水对离心机水滤器进行30 min冲洗浸润，然后加压至0.2 MPa进行气泡点试验，检测合格后连通离心灭活系统进行121 ℃、40 min 高压灭菌。

1.3.2 排渣时间设定

将培养的悬浮口蹄疫Re-A/WH/09病毒液用设定值按固定时间排渣，时间分别设定为10、15、20、25、30 min进行自动排渣，通过离心相同体积(3 000 L)病毒液，收集离心样的体积和渣液的体积，计算料液的回收率。

1.3.3 排渣浊度设定

使用在线浊度仪根据下游工艺要求的料液浊度进行排渣，浊度分别设定为30、40、50、60、80 NTU进行排渣，通过离心相同体积(3 000 L)病毒液，收集离心样的体积和渣液的体积，计算料液的回收率，分析不同浊度对料液的损失情况。

1.3.4 离心回收病毒液

用离心机将病毒液离心结束后，用灭菌磷酸盐缓冲液对离心机内残留的病毒液进行循环回收，将残留在离心机腔体里的料液置换出来，进一步提高料液有效成分的回收率。

1.3.5 损失料液146S含量测定

实际生产中最常用的146S定量方法主要是蔗糖密度梯度离心法：将病毒样品置于蔗糖密度梯度仪中离心，在离心力的作用下，样品中的病毒颗粒沉降到相应密度梯度层内，用紫外分光光度计(259 nm)检测最高吸收峰(其他级份层上没有吸收峰),收集146S吸收峰级份，对146S含量进行定量[3]。

2、结果与分析

2.1 排渣时间

随着离心时间的增加，料液损失量相应降低。离心时间设定在20 min时料液损失相对较少(见表1)。

表1 不同离心时间的料液损失量

2.2 排渣浊度

随着浊度的增加，料液损失量相应降低。浊度设定在50 NTU时料液损失相对较少(见表2)。

表2 不同浊度的料液损失量

2.3 损失料液的146S含量

用蔗糖密度梯度离心法检测生产过程中病毒146S的收获量及离心过程中损失料液的146S含量。D230610号样品(离心时间20 min、浊度50 NTU)的料液损失量及146S含量相对较少(见表3)。

表3 损失料液的146S含量

3、讨论

3.1 通过对固定时间排渣的统计分析，排渣时间过短、次数过频会造成合格料液及其有效成分大量浪费；而排渣时间过长、次数过少则料液浊度较高，影响料液品质。收集离心样的体积排渣时间为10 min时料液损失量最大，收集到的离心样体积最小；排渣时间为20 min时收集到的离心样体积及离心浊度最佳。排渣时间为30 min时料液损失量最小，收集到的离心样体积最大。排渣时间设定较长，离心机腔体渣液过多，渣液反流到离心样里，收集到的离心样体积增多，但是离心样的浊度增高，给下游抗原浓缩纯化工艺生产增加了处理难度，造成料液有效成分损失和生产成本上升，因此排渣时间设定为 30 min 不符合生产工艺要求。

3.2 通过使用在线浊度仪根据下游工艺要求的料液浊度进行排渣分析，排渣浊度过小会造成合格料液及其有效成分的大量浪费，排渣浊度过高则直接影响料液品质。收集离心样体积排渣浊度在30 NTU时排渣较频繁，料液损失最大；排渣浊度在80 NTU时排渣次数较少，料液损失最小；排渣浊度在50 NTU时排渣次数及料液品质较稳定。排渣浊度在30 NTU时收集到的离心样浊度较低，但由于排渣次数过于频繁，病毒液中大量146S在离心排渣过程中随渣液一同被排出，造成生产成本大幅上升；同时由于离心样浊度过低，在下游抗原的浓缩纯化工艺过程中会降低拦截效率，增加抗原浓缩纯化难度，因此排渣浊度设定为30 NTU 不符合生产工艺要求。

4、结论

综合分析比较，在Re-A/WH/09病毒液离心过程中排渣时间设定为20 min, 排渣浊度在50 NTU时得到的离心样体积及浊度最佳，批间差最小，完整病毒颗粒(146S)的回收率最高，可降低生产成本，为生产优质高效的口蹄疫疫苗奠定基础。

参考文献:

[1]赵颖慧,何召庆.口蹄疫疫苗146S检测方法研究进展[J].中国畜牧业,2014(10):70-74.

[2]马艳粉,张丽丽,苏小艳,等.口服6种补益类中药提取物对口蹄疫疫苗免疫抗体应答水平的研究[J].中国预防兽医学报,2015(5):489-492.

[3]张怀宇,王泰健,赵启祖.口蹄疫灭活疫苗质量控制和检测技术的研究进展[J].兽医导刊,2007(3):135-139.

文章来源:张旭山,脱浩亮,芮弦等.不同离心参数对口蹄疫病毒有效抗原成分回收率的影响[J].贵州畜牧兽医,2024,48(01):26-27.