小球藻作为单细胞真核微藻,是一种重要的微藻资源。由于具有营养价值高、易大规模培养、可用于生产修饰复杂蛋白质且成本低廉等多重优点[1],小球藻可以作为一种环境友好型生物反应器用于生产活性物质,并有望逐渐成为医学、食品、工业研究等领域的新型模式生物。随着小球藻转基因技术研究的不断深入,目前已经有一些成功转化小球藻的报道,转化方法包括基因枪法[2]、农杆菌侵染法[3]、电击转化法[4]、聚乙二醇(PEG)介导法[5]等。研究者们将报告基因或者具有功能性的外源基因转入小球藻,并实现其表达[6]。但是以上方法均存在不同的缺点,如操作复杂、效率低、遗传稳定性差等,从而限制了小球藻作为生物反应器的规模化应用。因此,研发操作简单、转化效率高的遗传转化方法对于加快小球藻生物反应器的有效开发和利用是一条重要的途径。

近年来,纳米载体相关技术作为极具前景的技术之一而得到快速发展,已经在各领域发挥出巨大的作用[7]。磁性纳米材料由于具有特殊的理化性质和结构,因而可以被用作基因载体,进行磁转化[8],并且可以在一定程度上起到保护DNA的作用[9]。四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米颗粒是目前应用比较广泛的磁性颗粒,经过聚乙烯亚胺(PEI)修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒可以携带核酸分子在磁场力的作用下进行定向移动,从而富集在目的细胞表面,通过电荷之间的相互作用,在短时间内进行高效转化。磁转化最初被应用于逆转录病毒[10],随着纳米载体技术的研究日益深入,该技术因操作简单且高效,同时具有目的基因高效稳定表达、安全无害、靶向性高等优点[11],被国内外很多研究者用于进行体内外细胞基因转化试验,目前已经成功转化大鼠胃组织细胞、猪呼吸道上皮细胞及人细胞等[12]。由于植物细胞壁的屏障作用,使纳米载体介导的植物基因转化研究发展相对缓慢。Torney等于2007年利用二氧化硅纳米粒子结合外源基因转化植物细胞,首次成功获得了转基因植株,并将该技术成功应用于植物转基因领域[13]。研究者们随后利用磁性纳米基因载体技术对拟南芥[14]、水稻[15]等植物进行了遗传转化,并取得了一定成果,从而使纳米载体技术开始逐步应用于植物遗传转化方面。

椭圆小球藻为单细胞生物,直径为3～10μm,利用磁性纳米颗粒作为载体转化藻细胞在理论上是可行的。考虑到小球藻具有坚硬、复杂的细胞壁,不利于转化的进行,因此在利用磁性纳米颗粒对小球藻细胞进行转化时,要部分或完全去除小球藻的细胞壁[16]以制备半原生质体或原生质体,从而提高磁性纳米颗粒-质粒复合物进入细胞的概率,进而提高转化效率。本研究用直径为100nm的Fe3O4磁性纳米颗粒作为载体,介导外源基因对小球藻原生质体的转化,实现外源增强型荧光蛋白基因(EGFP)在小球藻中的转化与瞬时表达,为进一步通过基因工程技术深入开发小球藻生物反应器提供新思路。

1、材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1试验材料

椭圆小球藻F962购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库,并在固体平板上连续划线继代进行纯化;质粒pYBA1132、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株由笔者所在实验室保藏。

1.1.2试剂与仪器

磁性纳米颗粒CombiMAG-200、磁板购自Chemicell公司;配制培养基及溶液所用试剂购自国药集团化学试剂有限公司;质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;纤维素酶、半纤维素、果胶酶购自北京索莱宝科技有限公司;其他化学试剂均为国产分析纯。荧光显微镜为LeicaDM5500B生物显微镜。

1.2试验方法

1.2.1培养基与培养条件

椭圆小球藻培养基为SE+(亚硒酸盐富集的)培养基,1L培养基的配方如下:1ml2.9mmol/LNaNO3、1ml0.3mmol/LK2HPO4·3H2O、1ml0.3mmol/LMgSO4·7H2O、1ml0.17mmol/LCaCl2·2H2O、1ml1.2mmol/LKH2PO4、1ml0.4mmol/LNaCl、1ml0.09mmol/LFeCl3·6H2O、1mlEDTA-Fe(取4.1ml浓盐酸,用蒸馏水稀释至50ml,配制成1mol/LHCl,称取0.9306gEDTA-Na2溶解至50ml蒸馏水中,配制成0.1mol/LEDTA-Na2,称取0.901gFeCl3·6H2O溶于10ml上述已经配制好的1mol/LHCl中,然后与10ml已经配制好的0.1mol/LEDTA-Na2混合,加入蒸馏水稀释至1L)、1mlA5溶液[配方为2.86g/LH3BO3、1.86g/LMnCl2·4H2O、0.22g/LZnSO4·7H2O、0.39g/LNa2MoO4·2H2O、0.08g/LCuSO4·5H2O、0.05g/LCo(NO3)·6H2O]、5g葡萄糖、1g酵母提取物,pH值为7.0,固体培养基中需要加入1.8%琼脂。此外,固体平板划线培养条件为温度25℃,光照度4000lx,光照-黑暗周期16h-8h;液体摇瓶培养条件为温度25℃,转速140r/min。

1.2.2小球藻原生质体的制备

挑取固体平板上的单藻落,接种至20mlSE+培养基中,培养7d后,以10%的接种量转接至200ml培养基中,在光照摇床中培养至对数生长期。取200ml藻液,8000r/min离心5min,小心弃去上清,收集藻体。将藻细胞用无菌水洗涤3次,加入25ml酶解液[含有2%纤维素酶、2%果胶酶、2%半纤维素酶、0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)、0.12mol/L甘露醇,用0.22μm滤膜无菌过滤,现配现用],使藻细胞充分悬浮于酶解液中,于30℃、140r/min避光振荡条件下分别酶解5h、10h、20h、30h、40h、50h后,于8000r/min离心,弃上清,用0.02mol/LPBS(含有0.3mol/L甘露醇)洗涤3次,去除残留的酶解液,将藻细胞含量调整为1ml108～109个,分别在显微镜下观察小球藻原生质体/半原生质体情况,统计结果为3次观察结果的生物学重复平均值,每次重复至少统计3个具有代表性的视野中的原生质体数和半原生质体数。

1.2.3质粒的提取

如图1所示,质粒pYBA1132含有由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子与胭脂碱合成酶终止子(NOS)构成的EGFP报告基因的表达框。按照天根生化科技(北京)有限公司的无内毒素质粒大提试剂盒说明书抽提质粒,提取纯度(OD260/280)约为1.8,于-20℃保存备用。

图1含EGFP基因的pYBA1132载体图谱

括号中数字为酶切位点在序列中的位置(bp);ori-Rep为质粒复制起始位点;LB、RB分别为载体的左边界、右边界;左右边界中间部分的序列为可以整合至宿主基因组的片段;Kan为卡那霉素抗性基因;MCS为载体的多克隆位点;Nos-Ter、Nos-Pro分别为胭脂碱合成酶启动子、终止子。

1.2.4磁性纳米颗粒对质粒的吸附性及保护性分析

将磁性纳米颗粒CombiMAG-200和质粒按照1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20的质量梯度比例混匀孵育0.5h,制备磁性纳米颗粒-DNA复合物,将所有复合物中的DNA质量固定为2μg。通过琼脂糖凝胶电泳阻滞技术进行分析,以质粒作为对照,电泳结束后使用凝胶成像系统进行观察。在相同条件下,制备复合物后加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)进行酶切消化,将消化后的产物通过琼脂糖凝胶电泳进行观察,以未酶切的复合物作为对照。

1.2.5磁性纳米颗粒介导的小球藻转化

将磁性纳米颗粒CombiMAG-200和质粒pYBA1132按照1∶2、1∶5、1∶10的质量比混匀,在室温条件下孵育0.5h,制备磁珠-质粒复合物。在无菌操作台上,将24孔板置于磁板上,加入外加磁场,分别在不同孔中加入300μl经酶解处理的小球藻液与由不同质量比例磁性纳米颗粒-DNA复合物组成的混合液,用枪头轻轻吹打几次,混合均匀后进行共培养。在磁场作用下,带有磁性的纳米颗粒携带质粒按照特定方向富集于细胞上,磁转化2h后撤去磁场,取出藻细胞培养液继续培养。

1.2.6荧光显微观察

磁转化处理后的48h内进行荧光显微镜观察。用接种环蘸取微量藻液置于载玻片上,用清水稀释后,盖上盖玻片。首先用荧光显微镜在明场下寻找到小球藻视野,再用激发光观察EGFP基因在小球藻中的瞬时表达情况。

2、结果与分析

2.1小球藻酶解及酶解时长对半原生质体/原生质体生成的影响

由于小球藻细胞壁成分复杂、细胞壁较厚,并且不同小球藻种之间细胞壁差异较大,因此制作小球藻原生质体及半原生质体是转化体系中较为关键的一步。由于单一酶解液的效果并不理想,因此采用组合酶液对小球藻进行酶解处理。

取酶解不同时间的藻细胞,在光学显微镜下观察细胞状态。通过研究不同酶解时间对半原生质体/原生质体形成的影响发现:酶解时间不足,形成半原生质体/原生质体的数量较少;酶解时间过长,细胞酶解过度,又会导致细胞内容物溢出,无法形成完整细胞。综合分析,最佳酶解条件为在避光条件下于30℃、140r/min酶解30h,相应的原生质体/半原生质体形成率为55.7%(图2)。

图2酶解时间对半原生质体/原生质体生成的影响

2.2磁性纳米颗粒对质粒的吸附性

DNA小分子可以穿过琼脂糖凝胶,向电场正极方向迁移而形成条带。磁性纳米颗粒通过静电吸附作用与质粒相互结合形成磁性纳米颗粒-DNA复合物,将大量质粒吸附于磁性纳米颗粒上后,由于复合物的粒径相对较大,进行电泳时复合物会被阻滞于点样孔中而不随之迁移。当磁性纳米颗粒对质粒的吸附达到饱和以后,未被吸附的质粒则会在凝胶中进行迁移,因此对电泳后的凝胶进行观察分析便可以判断磁性纳米颗粒对质粒的吸附性能。图3的电泳结果显示,不同质量比梯度的磁性纳米颗粒-DNA复合物的结合能力不同,其中1～4泳道的质粒基本未迁移出点样孔,5泳道中有部分质粒开始迁移,表明磁性纳米颗粒与质粒的质量比为1∶1、1∶2、1∶5、1∶10时均可稳定结合,当质量比达到1∶20时,磁性纳米颗粒的吸附能力已经达到饱和状态。

图3磁性纳米颗粒-DNA复合物的琼脂糖凝胶电泳结果

2.3磁性纳米颗粒对质粒的保护性

外源基因在磁性纳米颗粒的携带下进入细胞后,细胞内部酶的消化作用可能导致DNA降解。而磁性纳米颗粒与质粒由于静电吸附作用形成的复合物紧密结合,产生了构象上的变化,可以在一定程度上保护DNA。因此,通过分析磁性纳米颗粒-DNA复合物能否免受酶解消化作用,能够检测复合物在进入细胞后对外源核酸的保护作用。制备磁性纳米颗粒-DNA复合物之后,用DNaseⅠ进行消化,以同样条件下未加入DNaseⅠ的磁性纳米颗粒-DNA复合物作为对照,进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示,磁性纳米颗粒在与质粒的质量比为1∶10及以内时均停留在点样孔中,未被消化,与未加入DNaseⅠ的复合物基本一致,磁性纳米颗粒呈现出良好的结合性和保护性;而当磁性纳米颗粒与质粒的质量比为1∶20时,由于结合达到饱和,质粒并未完全与磁性纳米颗粒结合而被降解;经过酶处理的纯质粒完全被降解(图4)。结果表明,在磁性纳米颗粒-DNA复合物中,磁性纳米颗粒可以与外源基因结合,从而有效保护DNA免受核酸酶的降解。

图4磁性纳米颗粒-DNA复合物酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果

1、3、5、7、9泳道为未经酶切的磁性纳米颗粒-DNA复合物,磁性纳米颗粒与质粒的质量比分别为1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20;2、4、6、8、10泳道为相同条件下经过酶切的磁性纳米颗粒-DNA复合物产物,磁性纳米颗粒与质粒的质量比分别为1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20;11泳道为未经酶切的质粒;12泳道为经过酶切的质粒。每孔中的DNA质量均为2μg。

2.4磁性纳米颗粒-DNA复合物转化小球藻的荧光瞬时表达

用纳米磁性颗粒介导EGFP基因转化小球藻细胞后,48h内进行荧光显微观察。图5显示,经质粒pYBA1132转化的藻细胞中部分发出绿色荧光,在视野中呈清晰的绿色,未被转化的藻细胞呈现红色,表明绿色荧光蛋白基因EGFP被成功转入椭圆小球藻F962中并表达出荧光蛋白。试验结果表明,由磁性纳米颗粒介导的小球藻遗传转化方法是成功的。

图5荧光显微镜下磁性纳米颗粒介导的绿色荧光蛋白基因EGFP在小球藻中的表达情况

a、b:不同视野下转化的小球藻;c:对照;a1、b1、c1:明场视野下的小球藻细胞;a2、b2、c2:叶绿体自发荧光;a3、b3、c3:细胞内EGFP荧光。

3、讨论

遗传转化体系的构建是开展基因工程研究工作的基础,而新型、高效的纳米载体技术的出现,加快了植物基因工程的研发速度。当前,已有研究将该技术应用于棉花[17]、水稻[15]等作物上,通过便捷稳定的操作,简化了转化过程中一系列繁琐的步骤,而且在遗传转化的过程中,受体材料的可选择范围广,磁性纳米颗粒对受体材料呈现出优良的安全性、稳定性与保护性。本研究首次尝试将磁性纳米颗粒介导的转化方法用于小球藻,小球藻作为当前最具经济潜力和生产价值的真核微藻之一[18],其应用范围广泛,可作为转基因技术良好的受体材料,但是由于其遗传转化方法的限制等原因,导致小球藻的基因工程工作进展缓慢。纳米载体具有独特的理化结构和转化原理,可以简化传统转化方法的操作步骤,装载大量核酸分子,并且在一定程度上保护与之结合的外源基因,从而提高转化效率。本研究结果表明,磁性纳米颗粒与质粒的质量比在1∶10及以内时均可以稳定结合且DNA不容易被DNaseⅠ消化降解,这是外源基因有效进入细胞进行转化的基础。

植物细胞具有坚实的细胞壁,小球藻的细胞壁是磁性纳米颗粒-质粒复合物进入受体细胞的障碍之一,因此利用酶解法去除小球藻细胞壁是转化过程中的第一步。小球藻细胞壁成分复杂,主要成分为纤维素和半纤维素[19],本试验使用混合酶解液制备小球藻半原生质体/原生质体,纤维素酶和半纤维素酶可以有效疏松其细胞壁,提高转化效果,并且对细胞的整体伤害小。酶解时间的选择是其中关键的一步,酶解时间过短,半原生质体/原生质体获得率较低;而酶解时间过长,细胞内容物流出,导致细胞不完整,无法作为转化受体进行高效遗传转化。本试验探究了酶解时间对椭圆小球藻F962半原生质体/原生质体形成的影响,最终确定了椭圆小球藻在30℃、140r/min条件下避光酶解30h时,获取半原生质体/原生质体的效果最佳。

本研究在转化过程中使用增强型荧光蛋白基因作为外源报告基因,EGFP基因为GFP基因的突变型,发射的荧光强度比GFP基因增加了约35倍[20],且已有报道表明该基因已经成功在杜氏盐藻中表达[21]。在本研究中,EGFP基因在小球藻中的瞬时表达结果清晰,因此更适合作为一种报告基因在小球藻中用于检测基因的瞬时表达情况。通过EGFP基因瞬时表达建立磁性纳米颗粒介导的转化方法作为构建生物新型遗传转化体系的初步探索,证明了此方法用作小球藻转化技术的可行性。

利用小球藻作为生物反应器生产功能蛋白质正在不断发展,虽然目前小球藻已经成功表达人生长素[22]、比目鱼生长激素[23]、兔防御素[24]等具有功能性的外源蛋白质,但是由于转化体系与方法不稳定等原因,限制了小球藻作为生物反应器的进一步开发和应用。因此,不断发展便捷稳定的转化方法和技术对于小球藻的开发利用尤为重要。磁性纳米颗粒作为载体介导转化方法,已经被证明可以用于小球藻的转化,相对于其他转化方法具有可以装载大量大片段DNA与操作简单等优势,具有一定的优越性。后续还需不断优化转化条件,建立更加稳定高效的遗传转化体系,为发展小球藻新型转基因技术提供理论基础。

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基金:国家重点研发计划项目(2017YFD0501005);北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20170415).