首页 > 论文范文 > 自然科学论文 > 生物学论文 > 遗传学论文 > 昆明地区β地中海贫血基因检测结果及红细胞参数特点分析

昆明地区β地中海贫血基因检测结果及红细胞参数特点分析

2025-03-26 87 上传者：管理员

摘要：目的：了解昆明地区人群地中海贫血基因携带率和基因型分布特点，并比较β+、β0杂合突变携带者与健康人群之间红细胞参数的差异，以及18-45岁成人不同性别间红细胞参数的差异。方法：回顾性分析2020年4月1日至2022年3月31日于昆明医科大学第一附属医院筛查地贫基因的病例3 195例，采用荧光PCR熔解曲线法检测中国人常见的β珠蛋白基因21个位点突变型。将携带β-地贫基因的单纯杂合子患者分为β+杂合子组、β0杂合子组，对照组为体检健康人群219例，收集红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(Hb)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)4项指标数据，比较β+、β0杂合子组与对照组4个红细胞参数的差异，以及在18-45岁之间β+、β0杂合子与健康人群不同性别间红细胞参数的差异。结果：确诊地贫基因携带者688例，占21.53%；包含β珠蛋白基因突变322例，其中β+杂合子145例，β0杂合子151例，β+纯合以及β+和β0双重杂合14例；β珠蛋白和α珠蛋白同时突变或缺失12例。β+地贫以CD26 G>A突变型携带率最高，占57.9%;β0地贫以CD17 A>T突变型携带率最高，占46.4%。将检出的296例β-地贫杂合突变携带者红细胞参数与正常参考区间比较，发现RBC大于参考区间最高值有218例，Hb、MCV、MCH小于参考区间最低值分别为105、281、269例。β+、β0杂合突变携带者与健康人群比较，4个红细胞参数均具有显著性差异(均P<0.001)，进一步不同性别间比较亦有显著差异(均P<0.001)。结论：昆明地区人群的地贫基因携带率、β杂合子地贫基因型携带率均处于较高水平，β+、β0杂合子携带者与健康人群红细胞参数有显著性差异。在进行遗传咨询时，应做好告知工作，在处于适婚年龄的成人中应该加强筛查，以预防重型地贫患儿出生。

关键词：
β地中海贫血
基因型
基因突变
红细胞参数
血液学表型
加入收藏

地中海贫血(简称地贫)是一种常见的单基因常染色体隐性遗传病,是由于珠蛋白基因发生突变或缺失,致使珠蛋白链合成受抑制,使形成血红蛋白的α链与β､γ､δ链比例失衡,而导致的一组遗传性溶血性疾病｡地贫根据突变的珠蛋白肽链位置,可以分为α-地贫､β-地贫､δ-地贫､δβ-地贫等类型,在中国以α-地贫和β-地贫最为常见[1]｡β地贫是由于β珠蛋白基因缺陷导致的遗传性溶血性疾病,是WHO关注的全球公共卫生问题之一,我国南方地区如广东､广西､海南､云南､贵州､江西､湖南､四川､重庆､福建､香港､澳门及台湾是β-地贫的高发区[2-3]｡在云南,以边境地区德宏和西双版纳高发[4]｡而随着社会发展,人口迁移流动,各区域之间地贫基因的携带率及基因型也在发生变化[5]｡人类β珠蛋白基因簇定位于第11号染色体短臂1区5带4亚带(11p15.4)[2]｡β-地贫是由于β珠蛋白基因发生突变,导致β珠蛋白基因的转录､前体mRNA的加工､mRNA的翻译及维持β珠蛋白肽链的完整性发生障碍,致使β珠蛋白肽链的合成不足或完全不能合成,直接影响正常的成人血红蛋白合成并引起α珠蛋白肽链与非α珠蛋白肽链的合成比例不平衡,从而导致α珠蛋白肽链相对过剩[6]｡相对过剩的α珠蛋白肽链可在红细胞内形成包涵体,导致红细胞膜氧化损伤,造成红细胞破坏及骨髓无效造血,临床上引起贫血､黄疸､脾大､骨髓腔扩大导致的地贫外貌等症状及体征,这是β地贫主要病理基础[5-7]｡临床数据显示,超过90%的β-地贫患者是由点突变所导致的[8]｡基因突变致β珠蛋白肽链的生成完全受抑制称为β0地贫,β珠蛋白肽链数量减少,部分受抑制称为β+地贫[9]｡

本研究主要分析2020年4月到2022年3月在昆明医科大学第一附属医院进行地贫基因筛查患者的地贫基因阳性率和基因突变类型及对比不同β突变所引起红细胞参数中红细胞(RBC)､血红蛋白(Hb)､平均红细胞体积(MCV)､平均红细胞血红蛋白含量(MCH)的变化｡

一、资料与方法

1.一般资料

回顾性分析2020年4月1日至2022年3月31日于昆明医科大学第一附属医院筛查地贫基因的病例3195例,检出试剂盒覆盖范围内的突变或缺失688例,其中对β杂合子携带者基因型进行分类并按β+杂合子和β0杂合子进行分组,并选取体检健康人群219例作为对照｡收集相关的红细胞参数,并比较RBC､Hb､MCV､MCH4个指标与健康人群的差异性｡碱基突变位点β+型:nt29A>G､CD26G>A､nt28A>G､IVSI-5G>C､nt30T>C､IVSII-654C>T､nt32C>A､IVSII-5G>C､nt73A>T､nt90C>T､nt31A>C;β0型:IVSI-1G>T､CD14-15(+G)､CD15-16(+G)､CD17A>T､CD27-28(+C)､CD30A>G､CD37G>A､CD41-42(-TTCT)､CD43G>T､CD71-72(+A)[10]｡由于小于1岁的婴幼儿血细胞各指标波动较大,而70岁以上人群红细胞造血功能减弱,所以小于1岁的婴幼儿､70岁以上人群不列入比较红细胞参数的分组;因1-17岁以及45岁以上携带者数量较少,在分性别比较差异时,仅比较18-45岁β单纯杂合子携带者与健康人群之间性别的差异｡

2.试剂与仪器

核酸提取试剂为西安天隆全血基因组3.0提取试剂盒;地贫基因检测试剂盒(分为缺失型α-地贫基因检测试剂盒､非缺失型α-地贫基因检测试剂盒､β地贫基因检测试剂盒)为厦门致善生物科技股份有限公司产品｡血细胞分析仪(XN-9000)为希森美康公司产品,试剂为厂家原装配套试剂;PCR扩增仪(SLAN96P)为上海宏石医疗科技有限公司产品;提取仪(GeneRotex96)为西安天隆科技股份有限公司产品｡

3.检测方法

XN-9000全自动血细胞分析仪进行血常规检测,样本为EDTA抗凝管抽取2ml静脉血,在血细胞分析仪进行检测后,主要观察RBC､Hb､MCV､MCH4项指标的结果｡RBC的正常值参考区间(3.8-5.10)×1012/L,Hb的正常值参考区间115-150g/L,MCV正常值参考区间为82-100fl,MCH正常值参考区间为27-34pg｡

地贫基因检测样本为EDTA抗凝管抽取2ml静脉血,采用天隆全血基因组3.0提取试剂盒提取DNA组,进行PCR扩增(厦门致善地贫基因分析试剂盒),采用荧光PCR熔解曲线法检测中国人常见α-珠蛋白基因的3种缺失型和3种突变型,β-珠蛋白基因21个位点的21种突变｡试剂盒反应体系设为25μl,反应程序:(1)PCR反应程序:50℃2min→95℃10min→(95℃15s→55℃15s→76℃20s)×55个循环;(2)熔解曲线分析程序:95℃1min→35℃3min→40-80℃以0.4℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析且在此阶段采集FAM､HEX､ROX和Cy5通道荧光信号,在实时荧光PCR仪上连续完成,程序运行完毕,根据熔解峰情况综合判断样本的基因型｡操作中开展阴阳性质控对照,以确保检测结果准确｡

4.统计学分析

使用SPSS27.0统计软件对数据进行分析,地贫突变基因检出率以百分比表示(%),计量资料采用x±SD表示,两组数据比较用t检验,多组数据比较采用单因素方差分析,P0.001为差异有统计学意义｡

二、结果

检出的β-地贫基因突变型占比分析

在3195例筛查病例中,确诊地贫基因携带者688例,占21.53%;包含β珠蛋白基因突变310例,其中β+杂合子145例,β0杂合子151例,β+纯合以及β+和β0双重杂合14例;α珠蛋白基因突变或缺失366例;β珠蛋白和α珠蛋白同时突变或缺失12例｡β+地贫以CD26G>A突变型携带率最高,占57.9%,其次是IVSII-654G>T突变型,占31.7%(表1);β0地贫以CD17A>T突变型携带率最高,占46.4%,其次CD41-42(-TTCT)突变型,占43.0%(表2)｡

β-地贫杂合携带者红细胞参数与正常参考区间的比较

收集检出的296例β-地贫杂合携带者红细胞参数的4个指标结果,将结果与正常参考区间比较,发现相关参数并非全部在正常参考区间范围内(表3)｡

β-地贫杂合携带者的红细胞参数特点

在携带β杂合突变的地贫携带者中,β+地贫携带率为4.54%(145/3195),β0地贫携带率为4.73%(151/3195)｡剔除小于1岁和大于70岁携带者的信息,RBC､Hb､MCV､MCH4个红细胞参数在β+杂合子､β0杂合子以及健康对照者之间有显著差异(均P<0.001)(表4)｡

β+杂合突变患者与健康人群在不同性别间的红细胞参数分析

选取18-45岁成人参与比较β+杂合子与健康人群不同性别间红细胞参数的差异,结果显示男性和女性的RBC､Hb､MCV､MCH均具有显著差异(均P<0.001)(表5)｡

β0杂合突变患者与健康人群在不同性别间的红细胞参数分析

选取18-45岁成人参与比较β0杂合子与健康人群不同性别间红细胞参数的差异,结果显示男性和女性的RBC､Hb､MCV､MCH均具有显著差异(均P<0.001)(表6)｡

三、讨论

据统计,世界范围内约1.5%的人口携带β-地贫基因(8000万人至9000万人),每年至少有上万例重型β-地贫患儿出生[11]｡本研究结果显示,昆明地区β+地贫以CD26G>A突变型携带率最高,占β+携带者的57.9%,β0地贫以CD17A>T突变型携带率最高,占β0携带者的46.4%｡β+地贫人群携带率为4.54%(145/3195),β0地贫人群携带率为4.73%(151/3195),与广东､厦门有差异,可能与云南少数民族众多有关[12-14]｡研究发现,地贫的临床表现与基因型密切相关,一般β+或β0基因突变杂合子为轻型地贫,可无临床症状或症状轻;而β+或β0的纯合子或β+和β0的双重杂合,β链生成部分或完全受抑制,可表现为重型地贫[15]｡本研究中统计到2例CD26G>A纯合子,Hb均在正常参考区间,1例nt28A>G纯合,Hb为23g/L,临床表现为极重度贫血｡由表3可以看出,大部分β杂合子会表现出MCV､MCH低于正常人群,RBC高于正常人群｡患者由于Hb成分改变,原卟啉与铁结合受抑制[16],患者会呈现小细胞低色素性贫血,造成MCV和MCH均低于正常人群｡Hb成分改变,携氧能力下降形成无效造血,而由于机体的反馈调节,致使促红细胞生成素生成功能增强,患者的造血机能日趋旺盛,致使红细胞数目不断增加,表现出RBC高于正常人群,但生成的红细胞并不能很好地执行红细胞功能｡少部分携带者并未表现出MCV､MCH减低,因此血常规结果在正常参考区间并不能代表没有携带地贫基因,红细胞参数在正常参考区间就不进行后续基因筛查可能会出现漏检｡从表4可以看出β0地贫比β+地贫所引起的血液学表型变化要严重一些,这与许吕宏等[11]研究一致｡β0杂合携带者Hb､MCV以及MCH均值皆小于β+杂合携带者,成人男女无论是β+或是β0杂合携带者红细胞参数都跟健康人群有显著差异｡

目前临床有关地贫治疗手段较为缺乏,规范性终身输血和祛铁治疗是治疗重型β-地贫的主要方法,造血干细胞移植是目前临床根治此病的唯一途径,而脾切除术或部分脾动脉栓塞术为对症治疗手段[11,17],但这些治疗方法对普通家庭造成的人力财力负担较大[18],所以在产前诊断中将受累胎儿淘汰是首选对策｡由于地贫具有遗传性,因此婚前筛查地贫基因､产前胎儿基因诊断十分重要,这样可以避免出现父母都为地贫基因携带者,无临床症状却生育出双重杂合重型地贫患儿的情况｡目前我国专家共识推荐的常规筛查流程是血常规､Hb电泳､地贫基因检测的三级筛查方案｡许多基层地区使用血常规结果表现为小细胞低色素性贫血,然后进一步采用Hb电泳筛查孕妇地贫,但效果仍不理想,无法避免一些特殊情况[19]｡因此,在后疫情时代,基层医院检验科PCR室可以考虑开展地贫基因筛查,提高检测效率,但荧光PCR熔解曲线法用于地贫突变或缺失的检测存在局限性,仅能检测已知β珠蛋白基因21个位点的21种突变｡除中国人常见的21种突变之外还有数百种罕见基因型和新发基因型,在条件支持的情况下可以选择更加准确和高效的检测方法,例如二代基因测序技术等｡在临床实践中,应综合考虑患者自身情况,选择不同筛查方法,以提高地贫检测准确性､降低漏诊率,预防重型地贫患儿出生｡本研究为预防新生儿出生缺陷提供了临床依据｡

参考文献:

1鞠爱萍,李友琼,林铿,等.中国广东省广州市花都区α-地中海贫血融合基因及表型分析.中国实验血液学杂志,2023,31(1):179-182.

2中华医学会血液学分会红细胞疾病(贫血)学组.中国输血依赖型β地中海贫血诊断与治疗指南(2022年版).中华血液学杂志,2022,43(11):889-896.

4赵钟鸣,姚莉琴,范丽梅,等.云南省两边境州六民族0~7岁儿童地中海贫血流行病学调查.中华流行病学杂志,2011,32(4):352-356.

5周晓萍,刘腾,庞雪利,等.地中海贫血基因检测结果及血液学表型分析.中国实验血液学杂志,2022,30(5):1527-1531.

8邓黎黎.血清铁蛋白､红细胞参数及血红蛋白电泳在地中海贫血患者筛查中的临床诊断价值.中国实验诊断学,2018,22(9):1582-1583.

10中华医学会医学遗传学分会遗传病临床实践指南撰写组.β-地中海贫血的临床实践指南.中华医学遗传学杂志,2020,37(3):243-251.

11许吕宏,方建培.《重型β地中海贫血的诊断和治疗指南(2017年版)》解读.中国实用儿科杂志,2018,33(12):940-943.

12吴琦嫦,周裕林,江雨,等.厦门地区β地中海贫血基因突变类型及产前基因诊断研究.中国优生与遗传杂志,2007,15(12):25-26.

13谢健敏,梁玉全,吴素琴.广东顺德地区β-地中海贫血流行病学调查.中国热带医学,2008,8(10):1687-1688.

14江雨,王文博,吴琦嫦,等.闽西南地区地中海贫血筛查及产前诊断的研究.中国妇幼保健,2008,23(32):4627-4629.

15徐湘民,张新华,陈荔丽,等.地中海贫血预防控制操作指南.北京:人民军医出版社,2011:21-22.