骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种常见的退行性关节疾病,病理发展过程以膝关节软骨下骨和软骨的退行性改变为主,是导致膝关节运动功能障碍和慢性致残的主要疾病之一,也是中老年人的常见病和多发病,临床表现主要以膝关节疼痛､肿胀､畸形,以及功能活动受限等为主[1]｡ 随着老龄化社会的到来,骨关节炎发病率不断上升,严重影响中老年患者的生活质量,同时也给患者家庭和社会带来巨大的经济负担｡ 流行病学调查显示,2010—2012年在美国有超过22.7%的成年人(5250万)患有关节炎,到2040年,预计会增长49%,将会有11.4%的成年人发生关节活动受限[2]｡ 因此,深入探讨其发病机制,在骨关节炎早期进行预防和治疗至关重要｡胃食管反流病( Gastroesophageal reflux disease,GERD)是指胃十二指肠内容物反流入食管所致的反酸､烧心等症状,以及进一步反流到咽喉部甚至肺等食管邻近器官导致的食管外疾病,如哮喘､慢性咳嗽､特发性肺纤维化､声音嘶哑､咽喉炎和牙蚀症等[3,4]｡ 一项流行病学研究显示,在西方国家大约10% ~20%患有GERD[5],到2019年,全球有7.8395亿 人 患 有GERD,近30年 增 长 比 例 达 到 了77.53%[6]｡ 有大量文献研究了年龄､肥胖､家族史､饮酒和精神因素等是GERD的危险因素[7-9],同样这些因素同样影响着OA的发展[10,11],但很少有人探索GERD与OA之间的关系｡ 此外,很多骨关节炎患者都会长期口服非选择性NSAID和环氧化酶2抑制剂进行治疗,这会导致胃黏膜的破坏,增加胃酸的分泌,这会不会导致GERD的发生呢?孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)是一种使用遗传变异作为工具变量(IV)识别危险因素和疾病之间的因果关系的强有力的方法[12]｡ 由于遗传变异已在受孕时就被确定｡ 使用SNPs替代暴露因素,一般不容易受到其他混杂因素影响,且MR研究满足因果时序性,是构成因果关系的基础[13]｡ 与传统的观察性研究相比,使用MR分析能更好地消除反向因果关联和混杂因素,从而获得让人信服的结果｡ 本研究收集已发布在GWAS中的数据集,使用two-samples MR分析GERD与OA之间的因果关系｡

一､材料与方法

1.研究设计:本研究是基于GWAS数据库进行双样本MR,通过探索发现GERD对OA存在正向因果关系,为了探索OA是否对GERD存在这样的关系;随后进行逆向MR｡ 考虑到BMI､饮酒和T2D是GERD和OA的共同危险因素,为了排除这些潜在的混杂因素的影响,本研究进行了多变量MR,以探讨GERD和OA的独立因果关系｡MR分析过程如图1｡

图1双向双样本孟德尔随机化设计

2.数据来源:

通过IEU Open GWAS project(gwas.mrcieu.ac.uk)网站获取有关于GERD和OA的数据｡与GERD相关的SNPs来自Ong JS[14]的2021年的研究项目,其中包括129 080例患者和473 523名对照｡ 与OA相关的SNPs来自Tachmazidou I[15]的2019年的关于欧洲人的研究项目,总共包括3个研究项目:Hip or knee osteoarthritis(39 427例患者和378 169名对照)､Hip osteoarthritis(39 427例患者和378169名对照)和knee osteoarthritis(24 955例患者和378 169名对照)｡ 为避免存在样本重复问题让结论更有说服力,我们在2017年Neale的研究项目(Non-cancer illness code self-reported:osteoarthritis)中进行了结果验 证,其 中 包 含28 257例 患 者 和308 902名对照｡ 有关于BMI的相关数据是来源于GWAS｡ 本文所涉及的所有数据均为欧洲人,男女不限,基本特征见表1｡

表1 MR研究中使用的GWAS数据基线

3.工具变量:

为更好地评估因果效应,MR分析中SNP作为IV应满足3个关键假设｡(1)V与暴露高度相关｡ 本研究中筛选SNPs除了满足P<5×10-8为筛选条件,同时设定连锁不平衡系数r2为0.001,连锁不平衡区域宽度为10000 kB,以保证各个SNP相互独立,排除基因多效性对结果的影响[16,17]｡ 此外,本研究还使用了F统计值,若SNPs的F统计量<10,说明该SNPs存在弱工具变量偏倚的可能性,进而将其剔除,避免对结果造成影响[16]｡(2) IV不与结局直接相关,仅通过暴露影响结局,即不存在基因多效性｡ 本研究以MR-Egger回归模型的截距项非0(P>0.05)表示不存在基因多效性[13,14,18,19]｡(3)IV与未测混杂无关｡ 由于MR方法选择的SNP遵循亲代等位基因随机分配给子代的遗传原则,受到的环境和后天生活的作用很小,即理论上可认为工具变量与社会经济文化等环境因素是相互独立的[15]｡缺失的SNPs在在线网站(R2>0.8) ( https: / / ldlink.nci.nih.gov)寻找具有高度连锁性的SNP代替,删除无替代位点的SNP[15],同时在Pheno-Scanner数据库(http: / / www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk / )中剔除与结局直接相关的SNP[20]｡

4.统计学处理:

本研究主要以逆方差加权法(IVW)[28]为主｡ 其特点是回归时不考虑截距项的存在并且用结局方差的倒数作为权重来进行拟合,不需要个体层面数据,可使用汇总数据直接计算因果效应值｡ 以SNP为工具变量,验证暴露与结局的因果关系｡ 其次,采用MR-Egger回归[29]､Weightedmedian[30]､加权模式和MR pleiotropy residual sumand outlier(MR-PRESSO)[31]等方法进一步对上诉结论进行补充｡ 其中,MR-Egger回归通过计算每个SNPs与暴露和结局的相关性(Y)及SNP与暴露的相关性(X),然后拟合线性函数,主要用于检测广泛的水平多效性｡ 加权中位数法:定义为比率估计值的加权经验密度函数的中位数,如果分析中至少有50%的信息来自有效工具,则可以评价因果关系｡MR-PRESSO则是首先计算去除每一个SNPs后的IVW结果,然后再计算该SNPs的效应与IVW结果的残差平方和,最后,把利用每个SNPs计算出来的残差平方和(距离)相加,这个值越大,说明水平多效性越显著｡ 为了量化IV与暴露的强度,我们引入F统计数字[32],公式如下:F = β2/ se2｡ 通过计算所有的IV从而挑出具有弱IV的SNPs｡ 所有统计分析均采用R4. 2. 2版本,使用了TwosampleMR及MR -PRESSO等R包｡5.水平多效性和异质性:在MR分析中,进行的水平多效性和异质性的检测｡ 多效性是指单个遗传变异不仅影响暴露,还影响结果,这是不符合MR原则的[33]｡ 本研究对MR-Egger截距进行检测,如果截距存在明显的统计学意义(P<0.05),说明该研究存在明显的水平多效性｡ 然后通过MR-PRESSO方法对离群值进行检测,若存在离群值,则将其剔除,并重新进行分析｡ 本研究应用Cochran’ s Q检验判断SNP的异质性[34],如果存在异质性(P<0.05),则采用随机效应IVW模型,反之则使用固定效应模型[35]｡ 此外,本研究使用通过遗漏一个SNP的方法进行敏感性分析[18]｡

二､结果

1.GERD特征对OA的影响:

(1)工具变量的选择:我们使用TwoSampleMR包获取到80个关 于GERD的SNPs作为IVs,然后通过Pheno-Scanner去检测是否与OA相关,结果未检测到OA相关的SNPs｡ 使 用TwoSampleMR包 检 测 出rs2145318､rs2558016和rs957345具有回文结构,MR-PRESSO包检测结果:在hip or knee OA中rs9940128为离群值;在hip OA未 发 现 离 群 值;在knee OA中rs569356､rs1716171和rs2744961为离群值;在Self-reported:osteoarthritis中rs13107325为离群值,并把这些异常IVs删除｡ 所有与GERD有关的IVs的F值均大于29. 75,这说明所有的SNPs均是强IV｡(2)GERD对OA的因果效应:MR的分析的结果如图2｡ 对于GRED和hip or knee OA的因果关系分析结果而言,通过四种算法发现了GRED的遗传易感性对hip or knee OA存在着明显的不利作用( IVW,OR= 1.547,95%CI = 1.448 ~ 1.652,P<0.001)｡ 此外,MR- Egger截 距( P = 0. 262 )和MR - PRESSO(P = 0.073)的P值均大于0.05,结果没有显示出水平多效性的证据｡ 漏斗图的结果显示IVs对称分布,同样未发现明显的水平多效性的存在(如图4A)｡Cochran’s Q检验的结果提示存在有一定的异质性(P=0.02889109)｡ 我们使用随机模型,使用“留一法”进行敏感性分析,发现结果较稳定｡ 这样的结论同样可 以 在hip OA ( IVW, OR = 1. 321, 95% CI =1.204~1.451,P<0.001),knee OA(IVW,OR= 1.754,95%CI=1.618 ~ 1.902,P<0.001)和自我报告的OA(IVW,OR=1.034,95%CI = 1.028 ~ 1.039,P<0.001)中观察到｡随后我们进行MVMR分析排除BMI对结果的影响,发现基因预测的GRED对hip or knee OA(IVW,OR =1.439,95%CI = 1.322 ~ 1.567,P<0.001),hip OA(IVW,OR=1.165,95%CI = 1.030 ~ 1.319,P = 0.015),knee OA(IVW,OR=1.674,95%CI = 1.505~1.861,P<0.001)和自我报告的OA(IVW,OR=1.031,95%CI=1.024~1.038,P<0.001)的发病风险仍存在关联｡

图2 GERD对OA的因果效应

2.OA特征对GERD的影响:

(1)工具变量的选择:使用TwoSampleMR包筛选关于OA的IVs,结果如下:在hip or knee OA中,共筛选出26个IVs,其中有8个SNPs是缺失的, rs2953013､rs56116847和rs9930333是离群值,未发现SNPs具有回文结构,删除这些异常IVs后剩余15个SNPs,所有IVs的F统计值均大于29. 83｡ 在hip OA中,共筛选出27个IVs,其中有9个SNPs是缺失的,2个SNPs具有回文结构,删除这些异常IVs后剩余16个SNPs,所有IVs的F统计值均大于29.94｡ 在knee OA中,共筛选出10个IVs,其中有3个SNPs是缺失的,2个SNPs具有回文结构,删除这些异常IVs后剩余5个SNPs,所有IVs的F统计值均大于31.52｡ 在自我报告的OA中,共筛选出2个IVs,他们的F统 计 值 均 大 于42.63｡ 然后通过Pheno-Scanner去检测是否与OA相关,结果未检测到OA相关的SNPs｡ 上诉结果说明所有的SNPs均是强IV｡(2)OA对GERD的因果效应:MR的分析的结果如图3｡ 对于hip or knee OA和GRED的因果关系分析结果而言,通过IVW和Weighted median算法发现hip or knee OA的遗传易感性对GERD存在着明显的不利作用(IVW,OR = 1.119,95%CI = 1.050 - 1.199,P< 0.001),MR Egger和Weighted mode的结果不支持这个结论,但他们的P值均大于0.05｡ 此外,MR-Egger截距(P = 0.746)和MR-PRESSO(P = 0.108)的P值均大于0.05,结果没有显示出水平多效性的证据｡ 漏斗图的结果显示IVs对称分布,同样未发现明显的水平多效性的存在(如图4B)｡Cochran’s Q检验的结果提示存在有一定的异质性(P<0.001)｡ 这样的结论同样可以在hipOA(IVW,OR = 1. 045,95% CI = 1. 015 ~ 1.076,P =0.003)､knee OA(IVW,OR = 1.161,95%CI = 1.057 ~1.276, P < 0. 001)和 自 我 报 告 的OA ( IVW, OR =137.463,95%CI = 1.017~18578.62,P = 0.046)中观察到,但是在hip OA中,其他三种算法(除了IVW)均不支持这个结论,但他们的P值均大于0.05,所以对于hip OA对GERD存在着不利作用这个结论的解读应该谨慎｡ 随后进行MVMR分析排除BMI对结果的影响,发现基因预测的hip or kneeOA( IVW,OR = 1. 137,95% CI = 0. 048 ~ 1. 235, P =0.002),knee OA(IVW,OR = 1.224,95%CI = 1.118 ~1.341, P < 0. 001)和 自 我 报 告 的OA ( IVW, OR =1.466,95%CI = 1.342 ~ 1.601,P<0.001)对GRED的发病风险仍存在关联｡ 但是在矫正了BMI的影响之后,hip OA和GERD的发病风险没有关联了(IVW,OR=1.044,95%CI=0.996~1.094,P=0.071),这更进一步说明hip OA和GERD之间关联的理解应该更加小心｡

图3 OA对GERD的因果效应

图4 GERD与OA之间关联的漏斗图

三、讨论

该研究通过使用双向MR分析探索欧洲人群的大型GWAS公共数据库,首次探索GERD与OA之间潜在的因果关系｡ 结果显示,GERD与hipOA､knee OA､hip or knee OA和自我报告的OA中都有着明显的不利作用｡ 此外,hip OA､knee OA､hip orknee OA和 自 我 报 告 的OA反 过 来 可 能 影 响 着GERD的发生,但在hip OA中,这样的关系会减弱｡这些结果表明GERD和OA中可能存在着双向正因果关系｡由于GERD和OA是属于不同的系统,他们之间的共同的基因很少被探索,目前我们并未寻找到有关于GERD和OA之间的关系的随机对照实验,而探索GERD和OA的相互作用的研究更是少之又少｡ 本研究是从先天的基因方面判断了二者之间的关系,缺少观察研究从表型上对他们之间的关系进行补充｡ 有研究报道,全身性OA患者具有很高的GERD合 并 症 的 风 险[36]｡Dell ' Isola等[37]认 为GERD与新诊断的髋关节OA存在相关性,但未继续深入探索他们之间的关系｡ 而且很多OA患者由于疼痛,会选择口服非甾体抗炎药物,从而促进胃酸分泌,这会改变食管上皮的转运机制[38],这可能促进GERD的发展｡GERD和OA均是常见的慢性疾病[39],到目前为止,他们发生的确切机制目前并不清楚,可能是多种因素共同作用的结果｡ 在OA中,白介素-1､白介素-6等炎症因子增加与肿瘤坏死因子高水平表达可能是由于体内炎症的失控,进而引起促炎细胞因子､趋化因子和其他炎症介质的产生[40]｡ 且炎症还能诱导reactive oxygen species和脂质过氧化,刺激Nitric oxide的合成,进一步加重OA的氧化应激｡ 而在GERD中,这些炎症介质也都发现高表达[41],有研究认为这些炎症介质促进细胞内reactive oxygenspecies来降低脯氨酰羟化酶功能,这一发现支持GERD是由细胞因子介导的过程[42]｡GERD和OA的发生过程都有炎症因子的参与,这会不会是其相关性的原因呢?此外,肥胖的患者易患有GERD和OA的并发症[43]｡ 一项Meta分析认为BMI是GERD的独立危险因素,且随着BMI的增加反流症状会进一步加重[44]｡ 肥胖也是OA的危险因素, Thijssen等[45]认为体重增加不仅仅导致关节负重过大,而且会导致脂肪因子和血脂异常释放,从而参与OA的发展过程｡ 最近的一篇关于OA的危险因素的孟德尔随机化研究也证实了BMI是OA的危险因素[46]｡BMI在GERD和OA的关系中扮演着什么角色仍需进一步探索｡ 近年来研究显示,心理因素在GERD和OA的发生发展中有着重要的作用[47],焦虑和抑郁等心理因素是GERD和OA发生的重要风险因素,他们之间互相影响最终形成恶性循环[48,49]｡ 这些都可能参与GERD和OA之间的相互作用过程,具体的机制仍需探索｡与观察性研究不同的是,本研究具有几项优势｡首先,本研究主要使用了大样本的全基因组关联研究,能够更好地对GERD和OA进行全面分析｡ 其次,还额外使用了其他的几种方法,且结果保持一致｡ 最后调整BMI对结果的影响后,发现hip OA对GERD的影响似乎降低了｡ 但是,本研究还具有一定的局限性｡ 首先,在缺乏相同的祖先或家系内部数据集的情况下,我们无法避免因为不同祖先导致的不同后代表型的困扰｡ 其次,研究对象仅局限于欧洲血统的人群,虽然可以减少人口分层引起的偏倚,但无法证明其在其他种族的人群中适用｡ 此外,与所有的MR研究一样,本研究不能解决未观察到的多效性,因此结果可能会存在偏差｡ 最后,在自我报告的OA中,可用的IV较少,未能完成敏感性分析｡ 当具有更多显著SNP位点的更权威的GWAS数据集发表时,我们很可能会克服上述限制｡

总体而言,本研究证明了GERD和OA之间存在着双向因果关系,GERD对hip OA和knee OA的发病率具有不利作用,反过来,hip OA和knee OA也与GERD的风险升高有因果关系,但排除BMI对结果的影响后,hip OA对GERD的影响似乎降低了｡我们还需要进一步的科学研究以揭示隐藏在GERD和OA背后的机制｡ 最重要的是,我们的结论提醒临床医师要注意GERD患者预防OA以及OA患者预防GERD｡

基金资助:山西省长治市卫生健康委科研项目(202316);

文章来源:贺方正,廖长胜,吴涛,等.双样本孟德尔随机化研究胃食管反流病与骨关节炎的遗传诊断之间的相关性[J].齐齐哈尔医学院学报,2025,46(06):518-524.