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影响非洲紫罗兰花形改变的脉根LjCYC1基因的探索

2020-05-29 444 上传者：管理员

摘要：利用农杆菌介导法将百脉根花对称性基因LjCYC1转入非洲紫罗兰，进一步探讨其作用和功能。非洲紫罗兰LjCYC1转化植株的表型发生以下变化：（1）花的对称性明显改变，由辐射对称变为两侧对称，出现频率为14.3%;(2）花瓣向花冠基部裂开，且花瓣数减少，出现频率为57.1%;(3）部分或全部雄蕊花瓣化，出现频率为17.1%;(4）雌蕊花瓣化或退化，出现频率为11.4%。

关键词：
LjCYC1
百脉根
花对称性
遗传学
雌蕊花瓣化
非洲紫罗兰
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花的对称性作为被子植物花部结构的典型特征，近年来成为植物发育、进化、生态及分子生物学的研究重点之一。被子植物的花形根据其对称面的有无分为3种（Endress,2001）：辐射对称花（actinomophy，具有多个对称面）、两侧对称花（zygomophy，只有一个对称面）、不对称花（asymmetry，没有对称面）。自从Luo等（1996,1999）从金鱼草中克隆了CYCLOIDEA后，其花形分子调控机制已经研究得比较清楚，主要是由调控花背部特性的CYC基因、DICHOTOMA(DICH）基因、RADIALIS(RAD）基因和调控腹部特性的DIVARICATA(DIV）基因决定。花对称性的研究除在金鱼草上取得很大进展外，研究对象已扩展到金鱼草的近缘类群，如菊科、苦苣苔科、豆科、忍冬科和川续断科、十字花科等，甚至扩展到单子叶植物禾本科、兰科等。

系统发育分析表明，在被子植物进化过程中CYC类基因发生过两次大的复制事件，最终形成CYC1、CYC2和CYC3等三大分支。控制花对称性的关键基因CYC和DICH均属于CYC2分支成员，而关于CYC1和CYC3分支功能的研究很少，其功能仍不清楚，只在拟南芥中发现CYC1同源基因TB1抑制玉米侧枝的形成。Feng等（2006）从豆科植物百脉根中获得了4个CYC的同源基因，发现LjCYC2为组成型表达，所有的花瓣均呈现背部花瓣属性；LjCYC1编码的蛋白质特异定位于细胞核内，起调控作用；通过RNAi基因沉默技术抑制3个LjCYC基因的表达，会引起花背腹轴分化的丧失，所有的花瓣都与腹瓣相似。在烟草中转化正义LjCYC3的植株表现为花瓣和雄蕊数减少；而转化反义LjCYC3的植株表现出2朵花有一定程度的融合，花冠、萼片褪色等现象（张寒英等，2011）。花生转LjCYC2基因T1代植株的花出现多种新的表型，如龙骨瓣翼瓣化，旗瓣消失、开裂等（温世杰等，2015）。

非洲紫罗兰为苦苣苔科非洲苦苣苔属多年生草本喜阴植物，植株矮小，四季皆可开花，花色丰富，花与叶均有较高的观赏价值。Narendrahe和Mohandas(2003）利用根癌农杆菌将葡聚糖酶——几丁质酶基因转入非洲紫罗兰。本研究中通过农杆菌介导法将百脉根LjCYC1转入非洲紫罗兰，进一步探讨LjCYC1的作用和功能，以期获得花形改变的非洲紫罗兰转基因植株，为花卉植物的花形调控提供新途径。

1、材料与方法

1.1受体材料及其对潮霉素敏感性的检测

以非洲紫罗兰试管苗的幼叶为转基因受体材料。取无菌幼嫩叶片，划伤后分别接种到含0、10、15、20、25、30和40mg·L-1潮霉素的诱芽培养基中，培养30d后观察生长状况，统计外植体的死亡率，选择可以抑制受体材料生长的最低浓度Hyg作为筛选压。每个处理30块叶片，重复3次。

1.2叶盘法转化非洲紫罗兰

含百脉根LjCYC1质粒pCAMBIA1301-LjCYC1的根癌农杆菌GV3101由中国科学院上海植物生理生态研究所惠赠。在无菌条件下切取非洲紫罗兰幼叶（长约1cm），划伤表面，接种到愈伤组织诱导培养基（MS+1.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+30g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉）；预培养2d后用农杆菌（含Hyg抗性基因、GFP基因）侵染液（含Km和Rif）侵染15～20min，然后用无菌滤纸吸干菌液，转接到共培养培养基（愈伤组织诱导培养基+100µmol·L-1AS），黑暗条件下共培养3d；用含500mg·L-1头孢霉素（Cef）的无菌水将叶片冲洗3～5次，放到无菌滤纸上晾干后接种到延迟培养基（MS+1.0mg·L-1BA+0.2mg·L-1NAA+500mg·L-1Cef+10mg·L-1Hyg+30g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉）；延迟培养7～10d后转入筛选培养基（MS+1.0mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+500mg·L-1Cef+30mg·L-1Hyg+30g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂粉）中，待转化受体形成愈伤组织或分化不定芽后转入分化培养基中继续抗性筛选，最后将分化的丛生苗转入生根培养基，待苗长出根系后移栽，置人工气候室培养。

1.3cDNA的合成和检验

用CTAB法和Trizol法分别提取非洲紫罗兰转LjCYC1植株叶片的DNA和RNA，并以野生型植株为对照。RNA经反转录后（按照CWBIO公司的HiFiScriptcDNASynthesisKit试剂盒使用说明书进行），用Actin引物对cDNA进行检验。PCR反应体系为25μL:16μLddH2O、2.5μL10×PCRBuffer、2.0μL2.5mmol·L-1dNTPs、1.0μLActin正向引物（10μmol·L-1）、1.0μLActin反向引物（10μmol·L-1）、2.0μLcDNA模板和0.5μLTaqDNA聚合酶。PCR反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后分析比较。引物ActinF为5′-GGAGAAGATCTGGCATCACA-3′，ActinR为5′-CCTCCAATAAAGACACTGTA-3′。

1.4转LjCYC1非洲紫罗兰的GFP及PCR检测

取转LjCYC1再生非洲紫罗兰植株的根做成压片，在蔡氏荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。以非洲紫罗兰转基因植株的基因组DNA和野生型基因组DNA为模板，用LjCYC1特异性引物（CYC-F1:5′-AGAAGGACAGGCACAGCA-3′，CYC-R1:5′-TTTGGAGACATAGGGAAG-3′）和GFP基因特异性引物（GFP-F:5′-GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG-3′，GFP-R:5′-AAAGGGCAGATTGTGTGGAC-3′）分别进行PCR扩增。PCR反应结束后，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5转LjCYC1非洲紫罗兰不同部位的RT-PCR检测

为了解LjCYC1在非洲紫罗兰各器官中的表达情况，提取转化植株的根，营养生长期的叶，开花期的叶、花序梗、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊的总RNA，以Actin作为内参基因，对所有cDNA模板进行半定量RT-PCR分析。用LjCYC1特异性引物对反转录产物进行PCR扩增，Actin引物序列、PCR反应体系及反应条件同1.4。

1.6转基因植株的表型观察

经过分子检测的转基因和野生型非洲紫罗兰同时移栽到泥炭︰珍珠岩=7︰3的基质中，种植于杭州师范大学生命与环境科学学院人工气候室，在温度为（23±2）℃，14h光照/10h黑暗条件下培养。对转基因植株的生长和花器官特征进行观察记录，并与野生型植株进行比较分析。

2、结果与分析

2.1Hyg筛选压的确定

潮霉素对离体培养非洲紫罗兰叶片的生长及芽再生有强烈的抑制作用，由表1可见，在30和40mg·L-1Hyg的筛选培养条件下叶片再生芽受到严重抑制，全部褐化死亡。鉴于经过一段延迟培养后已有分化迹象的叶片抗性增加，同时为降低假阳性植株的数量，本试验中以30mg·L-1的Hyg作为外植体起始筛选压。

表1潮霉素对离体培养非洲紫罗兰叶片芽再生的影响2.2转基因植株的获得

经农杆菌侵染后的非洲紫罗兰叶片共培养后，在温度为（23±2）℃、12h/12h黑暗的培养条件下经过1周延迟筛选后，转入筛选培养基，30d后开始有抗性芽形成。将抗性芽转入分化培养基继续筛选，待小苗长至2cm时切下转入生根培养基，长出根系后移栽到花盆（图1）。

图1LjCYC1转化非洲紫罗兰的过程

2.3转基因植株的GFP检测

取转LjCYC1非洲紫罗兰再生植株的根制成压片，用蔡氏荧光显微镜观察，在蓝光激发下可清楚地观察到根的细胞核发出绿色荧光，而野生型的根没有这种现象（图2），这表明GFP已经在转基因植株中高效表达。

图2荧光检测转基因非洲紫罗兰的根细胞

2.4转基因植株的PCR检测

利用LjCYC1和GFP基因引物对随机挑选的8株转化再生植株的叶片进行PCR扩增检测。LjCYC1扩增结果（图3,A）显示，其中7株扩增出大约652bp的条带。

GFP扩增结果（图3,B）显示，有6株扩增出大约538bp的条带，而野生型对照均没有扩增出任何条带，这说明LjCYC1已初步整合到非洲紫罗兰基因组内。有1株只检测出LjCYC1而没有检测出GFP，可能是因为非洲紫罗兰基因组具有CYC的同源基因而导致LjCYC1基因假阳性扩增的结果。

图3LjCYC1(A）和GFP(B）基因的PCR检测结果

RT-PCR检测结果（图4）显示，外源LjCYC1在转基因非洲紫罗兰根、叶、花序梗、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊都高效表达，各组织中的表达量大致相同；营养生长期的叶中表达量高于生殖生长时期各个组织中的。

图4LjCYC1在非洲紫罗兰不同器官表达的RT-PCR分析

2.6转基因植株的表型

本试验所用的野生型非洲紫罗兰（图5,A；图6,A）花色为紫色，花瓣呈辐射对称，花从外向内依次由4轮花器官组成：第1轮花萼一般为5枚或6枚；第2轮花冠基部合生，花瓣为5瓣或6瓣；第3轮雄蕊与花瓣数相符，其中部分发育不良；第4轮1枚雌蕊。

转LjCYC1基因植株花结构受到不同程度的影响，主要有以下几种表型变化：（1）花的对称性明显改变，由辐射对称变为两侧对称（图7,A～C），出现频率为14.3%（表2);(2）花瓣向花冠基部裂开，且花瓣数减少（图7,D、E），出现频率为57.1%;(3）部分或全部雄蕊花瓣化（图5,B～D），出现频率为17.1%;(4）雌蕊花瓣化或退化（图5,C、D);(5）部分花萼变成花瓣（图6,B），出现频率为7.1%;(6）花萼数由野生型的5枚或6枚减少为4枚（图6,C），出现频率为7.1%。

在花4轮结构中表型变化最明显的是2、3轮，其出现频率达到70%以上。这些变化表明LjCYC1影响了非洲紫罗兰花的表型，使花4轮结构都有不同程度的改变。

表2LjCYC1转化非洲紫罗兰花表型的变化

图5LjCYC1转化非洲紫罗兰雄蕊、雌蕊的变化

图6LjCYC1转化非洲紫罗兰萼片的变化

图7LjCYC1转化非洲紫罗兰花对称性的变化

3、讨论

Wang等（2010）的研究结果表明，百脉根LjCYC1和LjCYC2在控制背部花瓣发育中功能上是冗余的，LjCYC3在侧瓣属性控制中起关键作用。Feng等（2006）的研究结果表明在百脉根中组成型表达LjCYC2使所有的花瓣均呈现背部花瓣属性，而该基因的突变体则表现为背部花瓣形状的改变及表皮细胞类型侧部化。在花生转LjCYC2基因的植株中观察到，在T1代转基因植株中大部分变异花的背部花瓣（旗瓣）形状有所改变，有向内凹陷的趋势，1.5%的花表现为旗瓣消失；在T2代转基因植株中则所有的变异花都具有两个背部花瓣（温世杰等，2015）。在烟草中转化正义LjCYC3植株表现为花瓣和雄蕊数减少；而转化反义LjCYC3的植株表现为2朵花有一定程度的融合，花冠、萼片褪色等现象（张寒英等，2011）。兰花CgAGL6转化烟草，转化植株的雄蕊出现花瓣化现象（胡立霞等，2011）。

本研究中所用的表达载体由烟草花叶病毒35S启动子启动，属于植株组成型启动子，可以不受外界环境条件的影响调控基因表达，几乎在所有植物的不同组织中都能表达。RT-PCR检测结果显示，外源LjCYC1在非洲紫罗兰的根、叶、花序梗、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊都高效表达，也验证了这一点。在LjCYC1转化非洲紫罗兰的T1代植株中观察到不同花型变异的花。这些花型的变异主要包括两种类型，一是花对称性的改变，由野生型的辐射对称花变为两侧对称花，甚至出现有明显背腹之分的花；二是花器官形态的改变，如花瓣向花冠基部裂开，雄蕊、雌蕊、花萼花瓣化。这些花型的变化可能是转基因共抑制所导致的，即转入的LjCYC1可能抑制了非洲紫罗兰中内源的决定花对称性的CYC类基因（如SiCYC1A和SiCYC1B）的表达，使非洲紫罗兰的花由辐射对称变为两侧对称；也可能通过改变非洲紫罗兰内源控制花器官属性基因（如B类和C类基因）的表达，从而影响花器官的发育，由于影响程度不同使得花器官形态的变异呈现多种表型。

本研究结果表明，转入百脉根LjCYC1可以改变非洲紫罗兰花的对称性，使雄蕊、雌蕊花瓣化，这为培育两侧对称花或重瓣花的非洲紫罗兰新品种奠定了基础。

参考文献：

[1]胡立霞,徐京,庞基良,王利琳,王慧中,余红.2011.春兰×大花蕙兰杂种AGL6同源基因的克隆及其功能研究.园艺学报,38(2):317-326.

[2]黄笛,孙明,袁存权,程堂仁,王佳,张启翔.2017.春黄菊族部分植物CYC2d同源基因的分离与功能初步分析.北京林业大学学报,39(4):63-71.

[3]温世杰,刘海燕,洪彦彬,黄霞,梁炫强.2015.转LjCYC2基因改变花生花瓣对称性的初步研究.热带作物学报,36(5):883-887.

[4]张寒英,胡江琴,向太和,梁海曼,王利琳.2011.百脉根花对称性基因LjCYC3转化烟草的研究.浙江大学学报(农业与生命科学版),37(1):13-21.

杨梦婷,徐京,庞基良.百脉根LjCYC1基因致非洲紫罗兰花形改变[J].园艺学报,2020,47(04):708-716.

基金:杭州市科技计划项目(20191203B07).