泌乳是哺乳动物重要经济性状之一,尤其在奶牛(奶水牛)、奶山羊等乳用家畜上最能直接体现其对畜牧业经济效益的影响,选育产奶性能高的优势群体在畜牧养殖业中具有重要意义。

目前,高产动物选育及产奶性状改良的分子育种技术主要有两种策略[1],一种是选择功能候选基因策略,即筛选与动物产奶性状密切相关的候选基因,另一种则是全基因组选择策略。随着高通量测序技术和单核苷酸多态性芯片的发展,许多不曾被关注的基因功能也越来越多地被挖掘出来。

动物产奶性状主要包括产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳脂量和乳蛋白量五方面。产奶是由主效基因-微效多种基因共同调控的数量性状,并受到饲养条件及外界环境等因素的影响[2]。利用分子标记辅助选育高产性状动物技术,是对动物产奶性状基因或与之连锁的遗传标记的选择,实现对控制性状的数量性状位点的选择,针对动物产奶性状有明显效应的基因,揭示泌乳相关基因调控机制,进而应用于动物泌乳性状的改良及高产动物选育工作中[3]。

二酰基甘油酰基转移酶是控制哺乳动物甘油三酯合成的关键微粒体酶[4,5],主要作用机制是使甘油二酯与脂肪酸酰基反应生成甘油三酯,主要包括二脂酰甘油酰基转移酶1和二脂酰甘油酰基转移酶2两个亚型。诸多研究者通过对哺乳动物DGAT基因的研究,表明其与动物脂肪沉积、产奶性能、泌乳质量等生产性状紧密相关。本文主要对哺乳动物DGAT1、DGAT2基因的克隆与定位、功能、生物学效应及其家畜的遗传多态性与产奶性状之间的关系进行论述,旨在为哺乳动物泌乳相关的分子标记筛选及生产实践提供参考和理论依据。

1、DGAT基因的克隆与定位

1.1DGAT1基因的克隆与定位

DGAT1属于胆固醇酰基转移酶家族,是催化TAG合成的关键酶,其编码基因也是编码活性蛋白质的基因,参与脂肪合成、储存及脂蛋白组装等过程[6],是哺乳动物体内重要的一种酶。

Cases等[7]研究者于1998年在小鼠上克隆得到DGAT1基因cDNA并证明了DGAT1的活性。Lardizabal等[8]用染料亲和及肝素层析法从真菌脂质体中分离出DGAT1。Winter等[9]和Bernard等[10]将DGAT1作为评定奶牛乳脂率和乳脂产量的候选基因,利用荧光原位杂交的方法在牛14号染色体的端粒区段定位到DGAT1基因,并检测出一个关于乳脂率的QTL。Grisart等[5]定位克隆发现DGAT1基因位于构建的BAC序列群的一个SUBSET上;牛DGAT1的mRNA序列包括245bp的5'非翻译区、1470bp的编码序列和275bp的3'非翻译区(3'-Untranslatedregion,3'-UTR)构成,由500多个氨基酸残基组成,分子量约为50～60ku,与微卫星CSSM66紧密连锁;猪DGAT1基因与微卫星SW2404紧密连锁;肖海霞等[11]以驴乳腺组织的RNA为模板,首次克隆得到驴DGAT1基因3'末端cDNA序列,其他物种尚未见报道(详见表1)。

表1不同物种DGAT1基因信息

1.2DGAT2基因的克隆与定位

DGAT2属于单酰基甘油酰基转移酶1(MonoacylglycerolAcyltransferases,MGAT1)基因超家族,研究表明,如果它在细胞内过表达,则会导致大量三酰甘油在细胞溶质微滴中积聚。该酶参与动物肌肉能量的代谢,是一种比DGAT1更为有效的酶[20,21,22]。

Lardizabal等[8]和Irshad等[17]从真菌脂质体提取DGAT2酶。小鼠DGAT2酶内具有1个跨膜结构域,3个N2糖基化位点和6个蛋白激酶C磷酸化位点。Stone等[24]认为大鼠DGAT2是一个完整的膜蛋白,其疏水区域长约66～115个氨基酸,可能存在两个跨膜区域或一个镶入膜双分子层的单结构域,并且大多数蛋白质位于跨膜区末端。人DGAT2基因家族中含有完全保守的HPHG序列,该序列与第一跨膜区的中性脂带区是DGAT2酶发生作用和功能的基础。高浓度的MgCl2对体外培养的细胞中DGAT2的活性具有抑制效应。DGAT2与DGAT1在哺乳动物组织中都可广泛表达,然而在基因定位、蛋白结构、所属家族、组织表达敏感性、对MgCl2敏感性等方面存在差异,可进行鉴别。

人DGAT2基因分子量约为40～45kDa,cDNA为2439bp,5'-UTR为230bp,3'-UTR为1042bp;小鼠DGAT2基因cDNA为2263bp,5'-UTR为177bp,3'-UTR为976bp;大鼠DGAT2基因cDNA为2320bp,5'-UTR为177bp,3'-UTR为976bp;牛DGAT2基因5'-UTR为198bp,3'-UTR为933bp,位于BTA14着丝粒末端,而BTA14末端存在影响产奶性状的主效基因[14];其他物种DGAT2基因定位未见报道(详见表2)。

2、DGAT基因功能相关研究

对家畜泌乳性状改良是当今遗传育种研究者的研究热点之一,利用挖掘候选基因策略寻找影响泌乳性状的主效基因,揭示其对产乳性状调控的分子机制,从而应用于家畜泌乳性状的改良。从基因水平上寻找与动物产乳性状等重要经济性状密切相关的主效基因及遗传标记,应用于高产奶家畜分子标记的辅助选择,实现早期良种选择,加快育种速度。近些年,研究者发现多种基因对乳腺发育和泌乳有调控作用,其中主要包括乳蛋白基因、摇摆基因、催乳素基因、糖皮质激素[18]、生长激素及生长激素受体基因、淀粉酶基因、核外基因和其他基因如DGAT基因及垂体特异性转录因子等[29,30]。

表2不同物种DGAT2基因信息

2.1DGAT基因在脂类代谢中的作用

在泌乳过程中,乳脂的合成受遗传、营养及环境等因素影响。乳脂主要由约98%的甘油三酯、少量的甘油二酯和甘油一酯、游离脂肪酸及维生素A组成。合成途径分为脂肪酸的合成、甘油三酯的生成及脂滴的形成三个过程。其中,脂肪酸及甘油三酯合成过程中有诸多基因编码的酶类参与调控并发挥关键作用。反刍动物乳腺上皮细胞中乳脂的合成过程如图1所示。

在哺乳动物体内,DGAT1酶在肠、脂肪和乳腺等组织中均有表达,不同年龄、不同物种各组织表达量存在显著差异;参与动物机体多个重要的生理过程,能以甘油二酯(DAG)和乙酰辅酶A为底物进行催化反应合成甘油三酯(TAG)如图2所示,当DGAT1基因沉默后,乳腺上皮细胞内的TAG含量显著降低,TAG在各种生理层面都有着重要的作用,参与肠道脂肪吸收过程,脂蛋白组装,血浆中TAG浓度的调节和TAG在肠绒毛上皮细胞中的储存,能调节脂肪细胞及动物哺乳期脂肪的储存。

DGAT2酶在肝脏[32]、肾脏[33]、白色脂肪等脂质代谢旺盛组织中[34]的表达水平最高。它是脂肪合成的关键限制酶,在脂质代谢中也发挥着重要作用。已有研究表明,与脂肪吸收,合成和沉积相关酶的基因可认为是研究动物部分生产性状数量性状基因座的候选基因,其多态性可能与动物乳脂率以及体脂等特征性状密切相关[15]。

图1反刍动物乳腺上皮细胞中乳脂合成[31]

图2DGAT在甘油脂代谢中的作用[6]

综上所述,动物体内DGAT酶催化产生的TAG是真核生物中性脂类的主要储存形式,其活性直接影响TAG在生物体中的储存。DGAT1和DGAT2能以相互补偿的形式在小鼠肝细胞中合成TAG,然而这两种酶的相互机制尚不明确[9]。TAG对于细胞膜形式、脂蛋白的运输具有重要作用,且能在动物营养缺乏和外界刺激应激时为机体提供能量;若TAG在体内过量可引起动物糖尿病、肥胖等疾病[14]。

2.2DGAT基因与泌乳关系的研究

DGAT基因是哺乳动物泌乳性状重要的候选基因,且DGAT1不能替代DGAT2在组织中的生理功能。敲除DGAT2基因的小鼠出生后不久死亡[9],而敲除DGAT1基因的小鼠仍能正常存活,肠道内虽能继续合成TAG,但不在组织中沉积,也不能正常泌乳[35,36],结果表明:敲除DGAT1基因会造成乳腺中TAG合成受损,影响乳腺的生理功能。小鼠在DGAT1沉默后缺少乳汁而不能喂养后代,这种缺陷与乳腺的上皮细胞发育受阻是相互关联的,但乳腺受损的关联机制尚不明确,间质组织中缺失DGAT1只是个体表现,群体水平有待验证。

乳脂率是评价动物产奶性能的主要指标之一,与乳制品的质量和风味密切相关。已有研究表明普通奶牛[37]DGAT基因与牛奶乳脂率密切相关;中国南方荷斯坦奶牛DGAT1基因与乳脂率有关;水牛[38,39]、西农萨能奶山羊[40,41,42]的DGAT1基因与奶中乳脂率及产奶量具有一定关联性;绵羊的DGAT2基因与其产奶量和乳脂率有关[43,44];牦牛DGAT1基因与乳质有关[49];三河牛DGAT1基因与其产奶性能相关[45];驴DGAT2基因与其产奶量有关[46]。研究者曾一度认为DGAT1基因与奶牛乳脂率及脂肪沉积密切相关,且主要集中在第8外显子AA→CG的双碱基突变导致的K232A氨基酸变异,K氨基酸残基对增加乳脂率、乳蛋白率及乳脂量有促进作用,而对产乳量产生负效应[14];此外,启动子区可变数目串联重复序列多态性对产乳性状也有一定影响。随着对乳腺生物学和泌乳功能调控机制深入的研究,研究者发现DGAT2基因多态性与奶牛产奶性能也显著相关。国外研究者表明与脂肪吸收、合成和沉积有关酶的基因均可作为是奶牛部分性状数量性状位点的候选基因,这些基因单核苷酸多态性与乳脂率、产奶量等性状也相互关联[18]。因此,DGAT1和DGAT2基因都可视为奶牛(水牛)、奶山羊等哺乳动物产奶性状的重要候选基因。

3、DGAT基因遗传多态性及与家畜泌乳性状相关性的研究

3.1DGAT1基因遗传多态性与家畜泌乳性状

关于DGAT1基因多态性与产奶性状间存在关联性已有大量研究报道,并在多国高产品种家畜群体得到验证。Griasrt等[5]提出用Q和q两个等位基因代表奶牛DGAT1上的赖氨酸和丙氨酸残基,随后Komisarek等[48]发现新西兰奶牛的Q等位基因能增加牛奶中脂肪的产量而降低蛋白的产量及总量,验证了这对等位基因在育种方面的重要地位。贾晋等[49]通过对奶牛DGAT1基因外显子8的AA/GC突变导致CfrI限制性酶切位点出现的研究,针对突变位点设计了一对特异性引物,建立了一种准确判定奶牛DGAT1基因型的PCR-RFLP方法,并进行了验证,结果表明DGAT1基因对中国荷斯坦奶牛产奶性状具有重要影响,可作为中国荷斯坦奶牛305d产奶量、乳脂量和乳蛋白量性状辅助选择的遗传标记。Schennink等[50]研究表明,DGAT1基因8外显子上的第232位氨基酸的改变,即赖氨酸突变为丙氨酸的氨基酸序列(p.Lys232Ala或K232A)能够影响牛奶乳脂组成和脂肪含量。Laridizabal等[8]发现DGAT1基因K232A多态性对牛产乳性状如牛奶产量、蛋白质含量、脂肪含量和脂肪酸组成具有重要影响,表明该基因多态性与产奶性状密切相关。娄佑武等[51]在研究吉安西杂母牛DGAT1基因第8外显子K232A突变的遗传多态性及其对乳成分的影响时发现,KA基因型个体比AA/KK基因型个体在乳成分性状上有一定的优势,可作为候选基因与QTL作连锁分析,用于数量性状的辅助标记选择。高小莉等[45]评估甘南牦牛DGAT1基因15内含子至17外显子区突变对乳品质性状产生的影响,结果表明该区上A等位基因的牦牛乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量及无脂固体含量显著较高。Dokso等[52]在热环境下K232A位点对牛产奶性状的影响,表明DGAT1的K232A对产奶某些性状的影响不是恒定的,与外界环境冷热相关,基因和环境共同作用影响奶牛产奶性状。Sourabh等[53]对摩拉水牛DGAT1基因进行研究,表明该基因g.A7013G与乳脂量显著相关,在扩大样本进一步验证后,可作为潜在的分子标记。朱春梅等[40]以DGAT1基因作为西农萨能奶山羊产奶性状的候选基因,分析该基因多态性及其与产奶性状的关系,表明DGAT1基因内含子15位点及其5'调控区的突变对奶山羊的产奶量和乳脂率显著影响。

3.2DGAT2基因遗传多态性与家畜泌乳性状

关于DGAT2基因多态性及其与家畜产奶性能的关联性研究相继报道。徐秀容等[54]对三河牛DGAT2基因5、6和7内含子的部分位点进行验证,发现内含子6MspI酶切多态性与牛平均乳脂率有极显著的相关性。刘新武等[55]发现中国荷斯坦奶牛DGAT2基因5内含子上存在AA、BB、AB和AC四种基因型,5内含子位点的变异对奶牛产奶量和乳脂率均有显著的影响。郭将等[56]利用PCR-RFLP方法检测草原红牛DGAT2基因的遗传多态性与泌乳性状关系,DGAT2是影响草原红牛乳中脂肪和干物质含量的一个主效基因,能够作为选育低脂及高干物质草原红牛的分子标记。鄢胜飞等[57]检测水牛DGAT2基因的单核苷酸多态性,探究摩拉水牛多态性位点的群体遗传特征,筛选出9个高度多态的SNPs位点,研究表明摩拉水牛群体中DGAT2基因遗传多态性丰富,具有较大的育种价值和性状改良潜力。朱春梅等[58]探究DGAT2基因与奶山羊产奶性状之间的关系,表明该基因对奶山羊产奶性能具有显著影响。谢建鹏等[59]结合牦牛产乳性能,检测DGAT2基因5内含子和6内含子区域突变并分析其遗传特征,表明6内含子突变能够影响乳品质性状,选育等位基因A的个体能够改善后代群体的乳品质。

综上所述,DGAT与脂肪的代谢以及脂类物质的沉积密切相关,在肠脂肪吸收、脂蛋白集合、血浆中TAG浓度的调节、脂细胞中脂肪的存储、肌肉中能量的代谢等生理方面发挥着重要作用,可作为研究哺乳动物部分生产性状QTL的候选基因,其单核苷酸多态性与动物的乳脂率,产奶量等泌乳性状直接相关。因此,DGAT基因可作为奶牛产奶性状选育的重要候选基因。

4、DGAT基因研究前景及展望

DGAT酶是动物机体内一种重要的酶,在维持动物正常生理活动中发挥关键作用。它是控制高TAG引起代谢异常综合征等病的潜在基因标靶。作为合成TAG的关键限制酶,它与脂肪代谢、组织中脂类沉积有紧密联系,可被视为研究动物部分性状QTL的候选基因。DGAT基因遗传多态性与产奶性状(尤其是乳脂量和乳脂率)以及与猪、牛等畜禽的肉质性状、屠宰性状、体脂性状等密切相关,可应用于分子标记辅助选择。关于动物DGAT基因的研究仍在不断深入,表明该基因与脂肪沉积、产奶性能及泌乳质量等性状具有密切的关联性。国内外研究者对奶牛(奶水牛)、奶山羊的DGAT1(K232A、5'调控区、5内含子至7外显子、8内含子、15内含子至17外显子等区域),DGAT2(5至7内含子等区域)研究较多,DGAT被认为是动物泌乳性能重要的主效候选基因之一。在新西兰,DGAT1基因已应用到奶牛的育种工作中。同时,该基因在结构或调控序列中的等位变异极为重要。在开展分子育种技术的相关研究时,应首先明确主效基因与相关产奶性状的连锁关系。

近年来,人们对骆驼乳、驴乳等特种乳营养价值和保健功能的认知度越来越高,特种乳及其乳制品受到越来越多消费者的青睐,促进了特种经济动物产业的快速发展。骆驼、驴等动物养殖规模日益扩大,但仍面临泌乳产量低、高品系良种筛选困难等亟待解决的问题。目前在驴、双峰驼等特种经济动物泌乳性状相关基因的研究较少,DGAT作为动物重要经济性状最具前景的候选基因之一,对DGAT基因的研究将有助于阐明哺乳动物产奶性状相关的分子机制及信号转导通路,将该功能基因的研究实施到骆驼、驴等特种经济动物良种筛选及育种计划中具有重要价值和前景。

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基金:新疆维吾尔自治区重点研发专项(201804081);国家自然科学基金(31471645).