真菌性皮肤病也叫皮肤癣菌病，是一种常见易复发的皮肤病，主要是由真菌引起的毛杆和角质层感染[1,2]。菌丝和芽孢可侵入角质层深部，甚至到达真皮层浅部。盐酸特比萘芬是一种高效、低毒的丙烯胺类广谱抗真菌药[3]，常见的外用剂型有乳膏剂、凝胶剂和搽剂等，临床上多用于治疗浅部皮肤真菌感染[4,5,6]。

本文参考文献[7,8]将盐酸特比萘芬采用醇类脂泡囊包载后制成凝胶剂，用于治疗深部皮肤真菌感染。类脂泡囊是合成的非离子性表面活性剂与胆固醇形成的一种单层或多层的药物载体，其结构组成和体内的物理性质与脂质体均相似，但它还具有自己特殊的性质:与脂质体相比，它的载体材料中不含磷脂，从而避免了磷脂的纯化、氧化降解，且其在生产和贮存过程中均不需要特殊条件，成本降低[9,10,11,12]。醇类脂泡囊又是在类脂泡囊基础上衍生出的一种新型载体，其不同之处在于囊材除有非离子性表面活性剂与胆固醇外，还加入了醇类，具有高度变形性和柔韧性[13,14]，是一种良好的促进药物经皮吸收的载体，能够携带药物到达皮肤深层。盐酸特比萘芬醇类脂泡囊凝胶不仅对浅部真菌感染疾病有效，而且对深部真菌感染疾病同样有效[15]，为治疗真菌感染皮肤病提供一种新制剂，也为皮肤外用给药提供一种新剂型。本文对盐酸特比萘芬醇类脂泡囊的制备工艺和药剂学性质评价进行研究。

1、试剂与仪器

盐酸特比萘芬对照品(批号:100563-201402，由中国食品检定研究院提供)，盐酸特比萘芬原料药(批号:170105，武汉拉那白医药化工有限公司);胆固醇(山东巨荣生物工程有限公司);吐温-80(化学纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);乙醇(95%，天津永晟精细化工有限公司);1,2-丙二醇(分析纯，天津永晟精细化工有限公司);磷酸二氢钠(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);磷酸氢二钠(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);AgilentTech.1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);TG-1650-WS型台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);SB-5200DT型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);BT125D型电子天平[赛多斯科学仪器(北京)有限公司];ZEN–3600Malvern型马尔文激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)。

2、方法与结果

2.1盐酸特比萘芬醇类脂泡囊的制备方法[17]

精密称取盐酸特比萘芬、胆固醇和吐温-80，置于烧杯中，加入一定体积乙醇，搅拌溶解，再加入一定体积1,2-丙二醇，混匀，即得醇相溶液。搅拌条件下，将醇相溶液注入一定体积的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，继续搅拌一定时间后再超声(250W,40kHz)分散一定时间，冷却至室温，即得。

2.2单因素试验

2.2.1囊材中吐温-80与胆固醇的用量比对包封率的影响

分别选取吐温-80与胆固醇的比例分别为2∶3,4∶3,6∶3,8∶3，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬醇类脂泡囊并测定包封率，结果见图1。当吐温的用量逐渐增大时，包封率明显减小，包封率在吐温-80与胆固醇用量比为2∶3时达到最大。

图1吐温-80与胆固醇的用量比对包封率的影响(n=3)

2.2.2囊材与主药的比例对包封率的影响

分别选取囊材与盐酸特比萘芬的比例分别为17∶3,17∶6,17∶9,17∶12,17∶15,17∶18,其他条件不变,分别制备盐酸特比萘芬醇类脂泡囊并测定包封率,结果见图2。包封率随着盐酸特比萘芬投量的增多而增大,当用量大于吐温用量的2倍时,包封率又略微减小,可能是随着主药的增多,包封逐渐达到饱和,在此基础上再增加药量,包封率变化不大;在囊材与主药比为17∶12时,包封率最大。

图2囊材与主药的比例对包封率的影响(n=3)

2.2.3搅拌时间对包封率的影响

吐温-80、胆固醇和盐酸特比萘芬按7∶10∶15进行投料，搅拌时间分别选取5,10,15,25,35,45min，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬醇类脂泡囊并测定包封率，结果见图3。随着搅拌时间的增加，包封率呈现先增加后减小的趋势，可能是因为搅拌时间过短，泡囊还未形成完全，而搅拌时间过长，又会破坏泡囊;当搅拌时间在25min时，包封率最大。

图3搅拌时间对包封率的影响(n=3)

2.2.4超声时间对包封率的影响

吐温-80、胆固醇和盐酸特比萘芬按17∶15进行投料，超声时间分别选取2,4,6,8min，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬醇类脂泡囊并测定包封率，结果见图4。随着超声时间的增加，包封率变化很小，其中超声时间为6min时，包封率最大。

图4超声时间对包封率的影响(n=3)

2.2.5醇相的含量对包封率的影响

吐温-80、胆固醇和盐酸特比萘芬按7∶10∶12进行投料，醇相含量分别为30%、45%和60%，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬醇类脂泡囊并测定包封率，结果见图5。随着醇相含量的增加，包封率逐渐减小。分析原因可能是因为醇相与主药在泡囊夹层存在竞争作用，使得主药包封率随醇相含量增加而减小;其中，在醇相含量为30%时，泡囊包封率最大。

2.2.6醇相中1,2-丙二醇的含量对包封率的影响

吐温-80、胆固醇和盐酸特比萘芬按7∶10∶15进行投料，醇相含量为30%，其中1,2-丙二醇含量为7%，14%，21%，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬醇类脂泡囊并测定包封率，结果见图6。随着1,2-丙二醇含量的增加，包封率变化很小，即1,2-丙二醇含量对包封率影响较小。其中，醇相中1,2-丙二醇的含量为10%时，包封率最大。

2.3正交试验

由以上单因素试验可知，囊材与主药投料比、搅拌时间以及醇相的含量这三个因素对包封率影响较大。以包封率作为评价指标，采用L9(34)正交试验对醇类脂泡囊的制备工艺进行进一步优化,因素水平见表1,正交试验结果表2,方差分析见表3。

图5醇相的含量对包封率的影响(n=3)

图6醇相中1,2-丙二醇的含量对包封率的影响(n=3)

表1因素水平表

表2正交试验表

表3方差分析表

由表2直观分析结果可知，影响包封率的因素排序由大到小依次为:C>B>A，即醇相含量>搅拌时间>囊材与主药投料比;最佳搭配为A2B2C1，即囊材主药比17∶12，搅拌时间为25min，二元醇含量为15%。方差分析结果显示:A、B、C三个因素对包封率影响无统计学差异。

2.4验证试验

2.4.1盐酸特比萘酚醇类脂泡囊的最佳制备条件

称取吐温14g，胆固醇20g，盐酸特比萘芬24g，置于烧杯中，加入一定27ml乙醇，搅拌溶解，再加入5ml1,2-丙二醇，混匀，即得醇相溶液。搅拌条件下，将醇相溶液注入70ml磷酸盐缓冲液(PBS溶液)中，继续搅拌25min后，超声(250W,40kHz)分散6min，冷却至室温，即得。

2.4.23份样品中盐酸特比萘芬包封率的测定

照“2.4.1”项下方法制备3份样品,分别测定包封率,结果见表4。按照最优的制备条件所得类脂泡囊中盐酸特比萘芬的包封率与正交表中的最大值相当,说明优选的制备工艺条件合理、可行。

表4验证试验结果表(n=3)

2.5盐酸特比萘芬醇类脂泡囊药剂学性质评价[18]

2.5.1包封率的测定

采用超速离心法:取醇类脂泡囊混悬液2ml，置2ml离心管中，超速离心(离心力7889×g)30min，取上清液0.5ml于5ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45μm微孔滤膜过滤后，采用HPLC法测定介质中游离的盐酸特比萘酚的含量，然后按照下列公式计算包封率(EE%)，测得包封率为96.79%。

式中,W游为介质中游离药物的量,W总为药物的总量。

2.5.2变形性的测定[17]

取6ml适当稀释后的盐酸特比萘芬醇类脂泡囊和6ml水，分别测定在1.1kg重物的压力下通过0.22μm微孔滤膜的性能，按照公式计算变形性(D)，测得变形性为86.67%。

式中,V醇类脂泡囊表示6ml盐酸特比萘芬醇类脂泡囊的过滤速度，V水表示6ml水的过滤速度。

2.5.3粒径、粒度分布和Zeta电位的测定

将盐酸特比萘芬醇类脂泡囊用PBS溶液适当稀释后用马尔文激光粒度仪测定粒径、粒度分布和Zeta电位，粒度分布如图7所示，Zeta电位如图8所示。泡囊的粒径主要在100～1000nm之间，粒度分布比较集中;测得平均粒径为226.1nm,Zeta电位为-4.78mV。

2.6HPLC法测定盐酸特比萘芬含量的方法学考察[16]

2.6.1对照品溶液的配制

精密称取6.25mg盐酸特比萘芬对照品，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.6.2供试品溶液的配制

取制备好的醇类脂泡囊混悬液2ml，置2ml离心管中，超速离心(7889×g)30min，取上清液0.5ml于5ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

图7盐酸特比萘芬醇类脂泡囊粒度分布图

图8盐酸特比萘芬Zeta电位图

2.6.3阴性对照溶液的配制

制备不加盐酸特比萘芬的空白类脂泡囊，照“2.6.2”项下方法操作，即得。

2.6.4色谱条件

色谱柱:Agilent-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水-三乙胺溶液(0.1%三乙胺溶液，用冰醋酸调pH至7.5)(95∶1∶4);检测波长:282nm;流速:1.0ml·min-1;柱温:20℃;进样体积:20μl。

2.6.5专属性考察

分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，各进样20μl，照“2.6.2”项下条件分析，记录色谱图，结果如图9所示。结果表明，在上述色谱条件下，供试品溶液中盐酸特比萘芬的色谱峰与杂质峰之间能得到很好的分离，且辅料对主药的测定无干扰，方法专属性良好。

图9HPLC色谱图

2.6.6线性关系考察

精密称取盐酸特比萘酚对照品6.25mg，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成标准品储备液。分别量取0.04,0.400,2.00,4.00,10.00m溶液置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得不同浓度的盐酸特比萘酚对照品溶液，分别照以上色谱条件测定峰面积。以盐酸特比萘酚对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=245.213X+31.1158,r=0.9999。结果表明:盐酸特比萘芬的浓度在1～250μg·ml-1之间与峰面积值呈良好的线性关系。

2.6.7精密度试验

精密吸取盐酸特比萘芬对照品溶液20μl注入高效液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图中峰面积并计算RSD为1.79%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.6.8重复性试验

取样品6份，分别制备盐酸特比萘芬供试品溶液，精密吸取20μl注入高效液相色谱仪，并按以上色谱条件进行测定，记录色谱图中峰面积并计算平均含量为23.88%(g·g-1),RSD为2.6%(n=6)，结果表明表明本测定方法重复性良好。

2.6.9稳定性试验

取同一份盐酸特比萘芬供试品溶液，分别于0,1,2,4,6和8h进样，每次进样20μl，记录色谱图中盐酸特比萘芬峰面积并计算RSD为3.19%(n=6)，表明样品溶液中药物在8h内稳定性良好。

2.6.10加样回收试验

取已知含量的盐酸特比萘芬样品共9份，精密称定后制备供试品溶液，分别精密加入相当于供试品溶液中药物含量80%、100%和120%的对照品，按本方法测定，分别计算加样回收率和RSD。结果盐酸特比萘芬平均加样回收率为96.2%，RSD为2.37%(n=9)，表明本法准确度高。

3、讨论

3.1本试验将盐酸特比萘芬用醇类脂泡囊进行包封，利用醇类脂泡囊具有透皮性能良好和囊材性质稳定等优点，为盐酸特比萘芬治疗深层真菌性皮肤感染病提供一种新载体。

3.2本试验构建的醇类脂泡囊是一种与柔性脂质体结构相类似的载体，其中非离子表面活性剂吐温-80为囊材，胆固醇用于支撑泡囊结构，乙醇和1,2-丙二醇为柔软剂，采用乙醇注入法将盐酸特比萘芬包封于醇类脂泡囊中，该泡囊粒径小、变形性好、药物的包封率高。

参考文献:

[1]贾杰.现代真菌病学[M].郑州:郑州大学出版社,2001:34

[2]王爱平,李若瑜,王瑞礼.特比萘芬治疗真菌病现状[J].中国新药与临床杂志,2000,19(7):4-7

[3]史丽敏.烯丙胺类抗真菌药-特比萘芬[J].中国药学杂志,1996,31(5):311

[4]何一鸣.盐酸特比萘芬二元醇质体经皮给药系统的研究[D].广州:广东药学院硕士学位论文,2015

[5]朱金燕,毛小明,薛红梅,等.醇质体在经皮给药系统中的应用研究进展[J].包头医学院学报,2017,33(12):130-132

[6]邢文善,路芳,王秋香.盐酸特比萘芬药物制剂的研究进展[J].中国药房,2016,27(4):553-555

[7]王朝,黄绳武.凝胶剂研究进展[J].医药导报,2010,29(02):223-228

[8]王学艳,寇欣,王雷.盐酸特比萘芬凝胶的制备与质量控制[J].中国医院药学杂志,2005,25(7):642-644

[9]张景勍,陆彬.类脂泡囊的研究进展[J].国外医药合成药生化药制剂分册,1999,20(3):188-192

[10]杜美菊,李纪钦.类脂囊泡包封维生素C的研究[J].信阳师范学院学报,2007,20(3):335-337

[11]刘立中.多西紫杉醇泡囊的制备[D].广州:广东药学院硕士学位论文,2009

[12]于黎鹏,杨君,杨跃辉.脂质体经皮给药系统的研究进展[J].实用药物与临床,2014,17(2):217-221

[13]唐帆,毕津莲.普鲁卡因柔性脂质体的制备及载药研究[J].中国医学工程,2007,15(9):715-716,719

[14]张岩.盐酸青藤碱柔性脂质体的制备及评价[D].沈阳:沈阳药科大学硕士学位论文,2008

[15]吴秀凤,龚珠萍,杨红,等.局部用咪喹莫特泡囊凝胶剂的制备､表征及皮内滞留效应[J].中国新药杂志,2015,24(1):97-101

[16]谭文业.HPLC法测定盐特比萘芬成膜溶液的含量[J].今日药学,2014,24(6):424-425,428

[17]何一鸣,何卓儒,朱秀城,等.盐酸特比萘芬二元醇质体的制备及体外评价[J].广东药学院学报,2015,31(2):139-144

刘宝,罗国平,闫梦茹,孟会宁,薛倩倩,申宇梅,张孟丽.盐酸特比萘芬醇类脂泡囊的制备及药剂学性质评价[J].中国药师,2019,22(08):1538-1542

基金:西安医学院药学省级重点学科建设项目(编号:2016YXXK10);2018年西安医学院校级大创项目(编号:2018DC-64)