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平贝母多糖的体外抗氧化活性及其提取工艺研究

2023-08-10 257 上传者：管理员

摘要：优化平贝母多糖的提取工艺并对其体外抗氧化活性进行研究,为进一步开发利用平贝母资源奠定基础。利用超声提取方法,采用响应面法优化平贝母多糖的提取工艺,通过测定平贝母多糖对DPPH自由基的清除率,评价其体外抗氧化活性。结果表明,平贝母多糖最佳提取工艺是料液比1︰29 g/mL,超声功率50 W,超声时间14 min,提取温度34℃。平贝母多糖的提取率为9.70%±0.10%。平贝母多糖主要由Glc组成,含有少量Ara和Gal,摩尔比99.3︰0.3︰0.4。平贝母多糖对DPPH自由基具有较好的清除能力,平贝母多糖质量浓度4 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除率为60.40%。响应面法优化超声提取平贝母多糖工艺是可行的,平贝母多糖具有较好的体外抗氧化能力,为平贝母多糖产品开发及利用提供试验依据。

关键词：
响应面法
多糖
平贝母
抗氧化活性
超声提取
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平贝母为百合科贝母属多年生草本平贝母（Fritillaria ussuriensis Maxim）的干燥茎[1]，亦称平贝，为我国东北珍贵药用植物之一，发展历史和使用历史较长，在临床应用和药材市场中占有重要位置。平贝母记载始见于《神农本草经》，将其列为中品，具有化痰止咳、清热润肺之功效。现代药理学研究表明平贝母具有平喘、镇咳祛痰[2]、抗炎[3]、抗氧化等多方面生物活性[4,5]。平贝母中含有皂苷类、生物碱类[6,7]、多糖类[8]、核苷类等有效化学成分。已报道关于平贝母中多糖的研究甚少。

天然的抗氧化剂具有安全、易获取、稳定性好等特点，因此从药食同源的植物中提取抗氧化剂成为研究热点。试验以平贝母为原料，采用响应面法对平贝母多糖的提取工艺进行优化，平贝母多糖体外抗氧化活性通过其对DPPH自由基的清除能力来评价，以期为平贝母资源的深层次开发与利用提供依据。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

平贝母（购自吉林省吉林市）。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，国药集团工业股份有限公司）；维生素C(VC，陕西京西药业有限公司）；单糖标准品（博睿糖生物科技有限公司）；苯酚、无水乙醇、正丁醇、氯仿、浓硫酸（均为分析纯）。

1.2仪器与设备

HN-1000CT恒温超声波提取机（上海汗诺仪器有限公司）；723型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；RE-529旋转蒸发器（上海予华仪器有限公司）；L-550台式低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；BS 110S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.3平贝母多糖的制备

平贝母粉碎后，过筛（0.180 mm，即80目）。圆底烧瓶内加入平贝母和无水乙醇（1︰5 g/m L），加热回流2 h，过滤，重复2次。脱脂后的平贝母过滤烘干，待用。平贝母采用超声辅助法提取，重复2次，滤液合并后浓缩至适当体积，用无水乙醇调整乙醇体积分数至80%，静置过夜（4℃），离心。沉淀复溶后按1/4的比例加入Sevage试剂，磁力搅拌30 min(4 000r/min），离心20 min，取上层清液重复操作。多糖溶液放入3 500 Da的透析袋中透析48 h，冷冻干燥得到平贝母多糖[9]。

1.4平贝母多糖提取率的测定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[10]测定，获得回归方程y=2.39x-0.011 1,R2=0.999 1。根据式（1）计算平贝母多糖提取率。

式中：C为多糖质量浓度，mg/m L;D为溶液稀释倍数；V为多糖溶液体积，m L;m为平贝母质量，mg。

1.5单因素试验

精确称取2.0 g平贝母干粉，在固定超声功率50W、超声时间20 min、料液比1︰30 g/m L、提取温度40℃条件下，考察料液比（1︰20,1︰25,1︰30,1︰35和1︰40 g/m L）、超声功率（30,40,50,60和70 W）、超声时间（10,15,20,25和30 min）和提取温度（25,30,35,40和45℃）对平贝母多糖提取率的影响[11,12]。

1.6响应面优化试验

平贝母多糖提取工艺采用响应面法进行优化[13,14]，以料液比（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、提取温度（D）为考察参数，多糖提取率为响应值。响应面试验的因素水平见表1。

表1响应面试验因素水平表

1.7紫外吸收光谱分析

配制平贝母多糖（0.1 mg/m L）溶液，用紫外可见分光光度计在190～900 nm波长范围内扫描。

1.8单糖组成分析

1.8.1单糖标准溶液的配制

配制16种10 mg/m L单糖的储备液。

1.8.2样品准备

精密称取5 mg样品置于安瓿瓶中，加入2 m L 3 mol/L TFA，于120℃水解3 h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5 m L水涡旋混匀，吸取50μL加入950μL去离子水，按12 000 r/min离心5 min。取上清进IC分析。

1.8.3色谱条件

色谱柱Dionex Carbopac TM PA20(3 mm×150mm）；流动相A为H2O，流动相B为15 mmol/L Na OH，流动相C为15 mmol/L Na OH-100 mmol/L Na OAC；流速0.3 m L/min；进样量5μL；柱温30℃；检测器为电化学检测器。

1.9红外光谱分析

根据参考文献[15]方法，精密称取1 mg平贝母多糖，与100 mg KBr晶体充分研磨，均匀混合后压片，在4 000～400 cm-1范围内扫描。

1.1 0 DPPH自由基的清除作用测定

根据参考文献[16]的方法，稍作改动。配制VC和平贝母多糖溶液（0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0和4.0mg/m L），分别取2 m L于试管中，加入2 m L 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混匀，避光反应（30 min），测其在517 nm波长处的吸光度，3次重复试验。以无水乙醇为空白对照，VC为阳性对照，平贝母多糖对DPPH自由基的清除率用式（2）计算。

式中：A0为无水乙醇+DPPH的吸光度；A1为多糖+DPPH的吸光度；A2为多糖+无水乙醇的吸光度。

2、结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1料液比对多糖提取率的影响

图1料液比对多糖提取率的影响

由图1可知，料液比中液体占比由1︰20 g/m L增加至1︰30 g/m L后，多糖提取率也逐渐提高。多糖提取率在料液比1︰30 g/m L时最大，为8.31%。料液比中液体占比继续升高增至1︰40 g/m L时，多糖提取率则降低。其主要原因是料液比中液体占比过小时多糖无法完全渗入溶剂而使得提取率偏低，料液比中液体占比过大时多糖会和其他可溶性组分相结合而造成提取率降低[17]。所以选取料液比1︰25～1︰35 g/m L用于优化试验。

2.1.2超声功率对多糖提取率的影响

如图2所示，超声功率由30 W增加到50 W时，多糖提取率逐渐增大。超声功率50 W时，平贝母多糖提取率达到最大值8.59%。超声功率大于50 W后，多糖提取率则缓慢降低，这可能是因为空穴效应导致溶剂中的气泡数增多，导致超声能量向介质传播的效率降低[18]。因此选取超声功率40～60 W用于优化试验。

图2超声功率对多糖提取率的影响

2.1.3超声时间对多糖提取率的影响

由图3可知，超声时间10～30 min时，多糖提取率先升高后逐渐下降，超声时间15 min时达到最大值9.67%，可能是超声10～15 min内对平贝母破坏作用较强，因此多糖提取率较高。超声时间继续增加后，平贝母多糖提取率缓慢下降，可能是由于超声时间过长，多糖结构被破坏[19,20]。因此选取超声时间10～20min用于优化试验。

图3超声时间对多糖提取率的影响

2.1.4提取温度对多糖提取率的影响

如图4所示，提取温度25～45℃区间内，多糖提取率先升高然后逐渐降低，35℃时，平贝母多糖提取率达到最高（10.02%）。因此选取提取温度30～40℃用于优化试验。

2.2响应面试验结果与分析

在Box-Behnken试验设计的基础上，进行四因素三水平响应面分析试验。在Design-Expert软件分析，试验设计与结果见表2。得到二次多项回归方程：多糖提取率（Y)=9.678-0.210 833A+0.085B+0.032 5C-0.091 666 7D+1.332 5AB+1.512 5AC+0.077 5AD-0.407 5BC+0.135BD+0.727 5CD-1.289A2-1.332 75B2-1.299C2-0.812 75D2。

图4提取温度对多糖提取率的影响

表2试验设计与结果

由表3可得，该模型F=85.46,P<0.000 1，表明模型极显著。试验设计中，响应面回归模型AB、AC、BC、CD、A2、B2、C2、D2项为极显著差异项（P<0.001),A项为显著差异项（P<0.01）。影响平贝母多糖提取率的排序是料液比（A）>提取温度（D）>超声功率（B）>超声时间（C）。模型决定系数R2等于0.988 4，表明回归模型显著性很高，而R2adj等于0.976 9，可以解释试验响应值在97.69水平上的变异情况，并且它与预测相关系数R2pred=0.941 6的数值也较为相近，表明该试验模型对真实数据有较好的拟合程度，对实际工作有一定的指导意义，据此可利用该模型对多糖提取率的最优提取工艺进行分析及预测。

应用Design-Expert软件分析得到提取平贝母多糖的最佳提取工艺：料液比1︰29.112 mg/m L、超声功率49.545 W、超声时间14.408 min、提取温度34.391℃，通过模型预测出的平贝母多糖提取率为9.789%。

在软件预测结果的基础上，考虑到实际工艺设定的可行性，将最佳工艺调整为料液比1∶29 mg/m L，超声功率50 W、超声时间14 min、提取温度34℃，在此条件下，重复试验3次，多糖提取率均值达到9.70%±0.10%，与模型预测结果相近，说明基于响应面模型的多糖提取率优化工艺分析方法有效且可行。

表3回归方程方差分析

2.3紫外光谱分析

图5平贝母多糖的紫外光谱

如图5所示，平贝母多糖在200 nm波长处有强吸收峰，在260和280 nm波长处有小的吸收峰，可能存在少量的核酸及蛋白质[21]。

2.4单糖组成分析

用16种单糖标准品作为对照，用离子色谱法测定平贝母多糖的单糖组成，单糖标准品和平贝母多糖的离子色谱图如图6和图7所示。结果表明，平贝母多糖主要由Glc组成，含有少量Ara和Gal，摩尔比为99.3︰0.3︰0.4。

图6单糖的离子色谱图

图7平贝母多糖的离子色谱图

2.5红外光谱分析

图8平贝母多糖的红外光谱

如图8所示：3 419.06 cm-1处吸收峰为O—H和N—H伸缩振动产生[22];2 926.83 cm-1处吸收峰由C—H伸缩振动产生[23];1 653.62 cm-1处吸收峰为多糖内—CHO及—COOH基团C=O伸缩振动产生，提示有糖醛酸存在；1 369.17 cm-1处吸收峰由C—H变角振动产生[24],1 155.40 cm-1和1 022.47 cm-1处有吸收峰为糖环的特征吸收峰，表明具有吡喃环特征结构[25],852.87cm-1和761.39 cm-1处吸收峰为α-糖苷键的特征吸收[26]。综上，平贝母多糖具有多糖的一般特征峰，具由α-糖苷键连接的吡喃环型多糖。

2.6平贝母多糖对DPPH自由基的清除能力

DPPH清除率检测是一种灵敏、快速、简单的方法，被广泛用于药品和食品抗氧化能力评估[27]。由图9可知，平贝母多糖质量浓度在0.2～4.0 mg/m L时，对DPPH自由基清除率随质量浓度的增大逐渐增强，质量浓度4.0 mg/m L时，其清除率为60.40%，达到最大值。平贝母多糖对DPPH自由基具有一定清除能力，表现出较好的体外抗氧化能力，但效果弱于VC。

图9平贝母多糖的对DPPH自由基清除作用3结论

3、结论

试验采用响应面法优化平贝母多糖超声提取工艺，通过平贝母多糖对DPPH自由基清除能力评价其体外抗氧化活性。得到最优工艺：料液比1∶29 g/m L、超声功率50 W、超声时间14 min、提取温度34℃。影响平贝母多糖提取率的排序是料液比>提取温度>超声功率>超声时间。在此工艺条件下，平贝母多糖提取率为9.70%。离子色谱测定平贝母多糖主要由Glc、Ara和Gal组成，摩尔比99.3︰0.3︰0.4。平贝母多糖对DPPH自由基具有一定清除能力，质量浓度4 mg/m L时，其清除率达到最大值60.40%。试验结果为平贝母多糖研究及其开发利用提供理论依据。

参考文献:

[1]侯立波,陈延宝平贝母化学成分的含量测定方法学研究进展[J]黑龙江医学, 2007, 20(2):158-159.

[2]李晓杰制平贝母对呼吸系统的保护作用研究[D].长春:吉林大学, 2018.

[3]陈泓竹张世洋黄雅彬等平贝母和川贝母总生物碱含量及其镇咳､抗炎作用比较研究[J].食品I工业科技, 2017,38(15):63-67.

[4]刘春红,马宇,何忠梅等平贝母多糖的分离纯化及抗氧化活性研究[J]食品科学, 2011, 32(21):29-33.

[5]沈莹孙海峰平贝母化学成分及药理作用研究进展[J].化学工程师,2018, 32(6):62-66.

[6]王曙,徐小平李涛,等川贝母与其他贝母类药材总生物碱和总皂苷的含量测定与比较[J]中国中药杂志,2002,27(5):342-344.

[7]李萍,莆令杰,李松林等无紫外吸收的贝母总生物碱定量分析方法研究[J]中国药学杂志,2002, 37(8):614-617.

[8]刘春红金钟斗,韩宝瑞,等平贝母多糖对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠的抗氧化作用[J].食品科学,2011, 32(23):285-288.

[9]胡栋宝.杜薇杨猛响应面法优化巨大口蘑多糖提取I艺及抗氧化活性[J]中国调味品,2021, 46(10):78-82.

[10]刘佳维张兴超,崔海洋等树舌多糖功能饮料的制备[J]食品工业,2022, 43(6):58-61.

[11]金立新,陈丽,高仁姣,等沙蚕多糖提取工艺及抗氧化活性研究[J]食品研究与开发,2020, 41(8)112-117.