金柑属为芸香科柑橘亚科柑橘族柑橘亚族真正柑橘类植物。柑橘类植物指的是柑橘属、金柑属、枳属及其杂种类型植物，由于这3个属各种之间极易杂交，不同地域间相互引种栽培，从而导致品种高度混杂，种质资源类型繁多，俗名层出不穷，出现同名不同种或同种不同名的现象(徐志祥等,2009)。由于分类标准不同，导致有关柑橘类植物的分类一直存在分歧，对各物种或品种之间亲缘关系的研究也有较大争议(张连峰等,2006)。

中国是金柑属植物的起源中心，30°N以南的地区是其主要分布区，且被大量引种到其它国家和地区(叶荫民,1983,作物品种资源,(4):2-5)。金柑在中国分布范围广泛，主要集中在广西、广东、湖南、江西、福建和浙江等地。至今研究者普遍认为金柑属包含6个种，分别是山金柑、罗浮、罗纹、长叶金柑、金弹和长寿金柑。

植物花粉的纹饰精巧、外壁结构复杂、外形独特，具有相对较强的遗传保守性和遗传稳定性，这对植物种和品种的鉴定具有重要的意义(武晓晓等,2017;唐艳等,2018)。张西丽等(2000)利用花粉电镜观察，采用聚类分析的方法将百合3个杂种系的品种得到了正确的归类。张锐等(2018)运用该方法将20个海棠品种分为四大类群。唐艳等(2018)对姑婆山野生皱皮柑和姑婆山野生元橘的亲缘关系进行了分析。金柑属中开发研究最充分的是金弹，其他种的开发应用尚未开展，金柑属和枳属资源的开发程度较柑橘属低，因此国内外对它们花粉形态相关的研究还不够全面。本研究收集了金柑属及近缘属36个品种的花粉，利用扫描电镜对其形态结构进行扫描观察，结合叶片形态特征分析各材料之间的亲缘关系，为金柑属种质资源利用和遗传改良研究提供依据。

1、结果与分析

1.1花粉的外部形态

不同品种的萌发器官均为具沟的萌发孔类型。大多数品种有4条萌发沟(图1B1)，其中‘宁波金弹CQ1’有3条萌发沟(图1B2)，枳属2个品种有5条萌发沟(图1B35;图1B36)，此外，‘福建四季桔CQ’、‘寿星橘’、‘大果金豆’、‘金柑杂种’和‘浏阳金柑6’偶尔存在5条萌发沟(图1B5-2;图1B6-2;图1B15-2;图1B25-2;图1B32-2)。萌发沟宽度均沿着花粉两端逐渐扩大。花粉的极面观形状大多数为四裂圆形，‘福建四季桔CQ’、‘寿星橘’、‘大果金豆’、‘金柑杂种’和‘浏阳金柑6’为四或五裂圆形，‘飞龙枳’、‘墨西哥飞龙枳’为五裂圆形，仅‘宁波金弹CQ1’为三裂圆形。赤道面存在3种形状，分别为圆形、近圆形和长圆形，其中大多数品种为长圆形，可见1～2条孔沟，‘飞龙枳’和‘墨西哥飞龙枳’可见2～3条孔沟。‘滑皮金柑’、‘浏阳金柑6’和‘15-1’为近圆形，‘富圆金柑’、‘温州大果罗浮’和‘浏阳金柑4’为圆球形。

1.2花粉的大小

金柑属、柑橘属和枳属品种花粉大小为比较小(10～25μm)或中等大(26～50μm)(表1)，不同品种之间存在着差异。其中‘富圆金柑’最小，‘温州大果罗浮’和‘浏阳金柑2’次之。枳属最大，包括‘飞龙枳’和‘墨西哥飞龙枳’，‘浏阳酸橘’和‘宁波金弹CQ1’次之。

根据柑橘类植物花粉越大进化程度越低，花粉越小进化程度越高的规律，表明‘富圆金柑’的进化程度最高，‘飞龙枳’和‘墨西哥飞龙枳’的进化程度最低。

1.3花粉外壁纹饰及形状

除‘富圆金柑’具有较复杂的纹饰以外，暂名为浮雕状纹饰(图1C7)，所有品种都具有网状纹饰或细网状纹饰(图1)；从网脊和网眼来看，‘寿星橘’和‘福建大果罗浮’的网脊最宽，此外，‘浏阳酸橘’、‘福建四季橘’的网脊较宽，‘飞龙枳’、‘墨西哥飞龙枳’和‘花叶金柑’的网脊最窄。网眼以‘宁波金弹CQ1’的最大，‘飞龙枳’和‘墨西哥飞龙枳’次之，‘花叶金柑’的网眼最小，‘富圆金柑’由于具有较复杂的纹饰而无法测量网眼大小以及网脊宽度。P/E均值以‘小果金豆’和‘大果金豆’的最大，‘富圆金柑’的最小，‘富圆金柑’、‘温州大果罗浮’、‘浏阳金柑2’为圆球形，‘滑皮金柑’、‘浏阳金柑4’和‘15-1’为近长球形，其它品种均为长球形(表1)。

1.4花粉性状聚类分析

根据花粉的5个定量特征对36份材料的极轴长，赤道轴长、网脊宽度、网眼直径和P/E值进行系统聚类分析(图2)。当欧氏距离为10时，可将36份材料分为4个分支。

第1支包括1份长寿金柑：6号；2份罗纹：16号、23号；2份山金柑：13号、15号；3份柑橘属材料：5号、26号、34号；3份罗浮：9号、11号、14号；1份野生金柑：29号；1份金柑杂种：25号；16份金弹：3号、8号、12号、17号、18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号、25号、28号、31号。其中，在欧氏距离为5时，第1支被分为2个分支。其中1-1支包括5号、6号、9号、11号、13号、14号、15号、16号、25号、26号、29号、34号材料；5号和26号它们均为柑橘属材料，6号‘寿星橘’被认为是金柑属与宽皮柑橘的杂种，因此5号，26号和6号材料亲缘关系较近且均具有相近的柑橘属花粉特征；13号、15号为山金柑，9号、11号、14号为罗浮，它们的共同特点是进化地位都比较低；25号、29号分别是金柑杂种和野生金柑，也聚在1-1支中；因此1-1支主要包括柑橘属、进化地位低的金柑属材料和金柑与柑橘的杂交种，并推测25号材料为金柑与柑橘的杂种。1-2支除23号为‘宁波罗纹CQ’，其余均为金弹，且该支中的金弹花粉粒大小属中等大，均为长球形，属于进化地位低的花粉形状。第2支包括1份罗浮：27号；4份金弹：7号、30号、32号、33号，它们的特点是花粉粒较第1支中的金弹小，且7号、27号、30号材料花粉粒最小，均为圆球形，32号、33号材料的花粉为近长球形。因此，第2支中的金弹进化地位较第1支中的金弹高。第3支包括1份柑橘属材料；1份金弹；2份枳属材料；这类材料的特点是花粉粒最大，网眼最大，网脊宽度最窄，属于进化地位最低的材料。第4支包括2份金弹：4号、10号材料。

图1扫描电镜观察花粉形态

表1试验材料及花粉电镜扫描形态特征

图2基于花粉形态的金柑资源聚类分析

1.5叶形态观察

参照柑橘种质资源描述规范和数据标准(江东等,2006)，对36份材料的叶片形态特征分别进行了调查，包括叶型、叶身形状、叶尖形状、叶基形状、叶缘和翼叶形状等特征(表2)。

在叶型上(图3)，除枳属为三出复叶以外，金柑属和柑橘属品种均为单叶，显示金柑属和柑橘属亲缘关系更近；大多数金柑属品种叶身形状为菱形或卵圆形，‘小果金豆’、‘大果金豆’、‘花叶金柑’、‘温州大果罗浮’和‘福建大果罗浮’均为披针形，柑橘属为圆形，枳属为倒卵形，显示了近缘属间的差异。在叶尖形状上，大多数品种叶尖短尖，其中‘宁波罗纹CS’、‘福建四季桔CQ’、‘寿星橘’、‘温光橘’、‘飞龙枳’和‘墨西哥飞龙枳’叶尖钝圆，‘小果金豆’、‘大果金豆’、‘福建大果罗浮’、‘温州金弹CS’、‘宁波罗纹CQ’、‘金柑杂种’、‘温州大果罗浮’、‘融安金弹’和‘福建四季桔CS’叶尖渐尖。在叶基形状上，大多数金柑属品种和枳属为楔形，柑橘属如‘福建四季桔CQ’、‘福建四季桔CS’、‘温光橘’等为广楔形，‘寿星橘’也为广楔形，可能与它是柑橘属和金柑属的杂交种有关；在叶缘上，大多数品种为浅波缘，少数如‘富圆金柑’、‘滑皮金柑’等栽培广泛、商业开发充分，进化地位较高的品种为全缘，且它们的叶表面较光滑；在翼叶上，大多数品种均有翼叶，为倒披针形或线形，‘小果金豆’、‘大果金豆’和‘富圆金柑’等无翼叶。

2、讨论

花粉形态在种质资源评价和品种鉴定中具有重要意义。本研究对金柑属及其近缘属花粉形态进行观察，发现在花粉形状、大小、外壁纹饰等方面表现出多样性。金弹中‘浏阳金柑6’和‘15-1’的花粉形状均为近长球形，且聚类图中它们和‘富圆金柑’、‘浏阳金柑4’(圆球形花粉)关系较近，推测它们可能有进化成圆球形花粉的趋势，且这4个品种聚成一支，与长球形的金弹不在同一分支。

表2金柑属植物叶形态特征描述

花粉的体积大是进化地位低的表现，体积小是进化地位高的表现(Walker,1974)。本研究中，‘飞龙枳’、‘墨西哥飞龙枳’和‘浏阳酸橘’的花粉最大，均为长球形，进化地位较低；而且花粉粒较大的金弹也与柑橘聚类在一起，因此推测‘飞龙枳’、‘墨西哥飞龙枳’和‘浏阳酸橘’的进化地位低。而‘富圆金柑’的花粉极小，呈圆球形。富圆金柑为“融安金柑”自然芽变变异产生的新品种，其具有质地爽脆、味甜、少核的优点(农桂,2016,农村新技术,(1):37-38)。外壁纹饰的演化趋势大致为从网脊狭、网眼大向网脊宽、网眼小发展，条脊相互交织的复杂纹饰是进化的表现。本研究中‘富圆金柑’的外壁纹饰为前人研究中未描述过的复杂类型，暂命名为浮雕状纹饰，因此推测‘富圆金柑’的进化地位高，而且有可能成为金柑属内一个新的品种。本研究中‘飞龙枳’和‘墨西哥飞龙枳’为长球形，与武晓晓等(2018)的结果矮化枳为圆球形不同，推测枳属品种间存在着较大差异。萌发沟的形状则以两端扩大为进化程度最高(叶荫民等,1982)，本研究中金柑属植物花粉的萌发沟宽度沿花粉极轴方向逐渐扩大，而柑橘属和枳属的花粉没有此特征，进一步说明柑橘属和枳属的进化程度低。‘宁波罗纹CQ’与‘宁波罗纹CS’的花粉形态特征相差较远，且在叶形上也有较大差异，猜测可能是由于地理环境的影响，使得在种内产生了较大变异，显示了金柑属植物遗传背景复杂的特点。

图3金柑资源叶片形态

本研究结果表明花粉形态特征分析可以为柑橘类植物的亲缘关系研究提供依据，但是由于柑橘属植物品种复杂，而本试验所选取的柑橘属材料比较少，其各物种之间的亲缘关系及遗传起源还需要借助其他研究手段进一步明确，且目前金弹的品种开发应用较充分，其他品种开发程度低，在今后的研究中可以通过杂交育种和诱变育种进一步改良，丰富金柑品种类型。

3、材料与方法

3.1实验材料

试验材料采自中国农科院柑桔研究所(重庆)、湖南省园艺研究所(长沙)和广西柑桔研究所，共计36份材料，现生长在湖南农业大学金山基地。1号、5号、26号、34号为柑橘属材料(表3),35号、36为枳属材料，其余均为金柑属材料，其中13号、15号为山金柑，9号、11号、27号为罗浮，16号为罗纹，6号为长寿金柑，其余材料均为金弹。

3.2花粉电镜扫描观察和数据统计

于盛花期取刚开的花，直接将花粉涂抹在样品台上，真空喷金之后置于SEM-6380LVB扫描电子显微镜下观察，工作电压为15 kV，分别在3 000倍、10 000倍下观察，拍照，测量极轴长(P)、赤道轴长(E)、网脊宽度(W)和网眼直径(D)的大小，并计算极轴长(P)与赤道轴长(E)的比值，即P/E值。每份试验材料选取具有代表性的花粉粒进行相关数据的测量和统计，用Excel进行统计，SPSS软件计算平均值和标准差，系统聚类法对极轴长、赤道轴长、网脊宽度、网眼直径、P/E值5个定量特征进行聚类。根据Erdtmand1952、1969年的方法，将花粉的形状分为7种类型(表4)。花粉性状描述参照Walker(1974)的研究方法。

花粉大小的划分依据是以花粉粒的最长轴的长度来划分的。大多数孢粉学家将大小分为以下6级(李天庆等,2011)：花粉很小：<10μm；花粉比较小：10～25μm；花粉中等：26～50μm；花粉比较大：51～100μm；花粉很大：101～200μm；花粉巨大：>200μm。

表33 6个柑橘类品种信息Table3Inform ation of3 6citrusvarieties

表4花粉基本形状和等级分类

3.3叶形态观察

参照柑橘种质资源描述规范和数据标准(江东等,2006)，对36份材料的叶片形状分别进行了调查，包括叶型、叶身形状、叶尖形状、叶基形状、叶缘和翼叶形状等特征，并拍照保存(图3;表5)。

孔维政和黄红梅是本研究的实验设计者和实验研究的执行人；孔维政、章翼及黄红梅完成数据分析、论文初稿的写作；易自力参与实验设计、试验结果分析；黄红梅是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

表5柑橘类植物叶形态特征分类

参考文献:

[1]江东,龚桂芝,洪棋斌,叶庆亮,王成秋,赵学源,李喜庆,主编,2006,柑橘种质资源描述规范和数据标准,中国农业出版社,中国,北京,pp.13-17.

[2]李天庆,曹慧娟,康木生,张志翔,赵楠,张晖,主编,2011,中国木本植物花粉电镜扫描图志,北京科学出版社,中国,北京,pp.1-11.

[3]唐艳,武晓晓,刘冰浩,陈传武,牛英,邓崇岭,2018,广西姑婆山野生柑橘资源花粉形态观察及其系统分类学研究,西北植物学报,38(6):1065-1071.

[4]武晓晓,唐艳,邓崇岭,2017,柑桔孢粉学研究进展,中国南方果树,46(5):148-153.

[5]武晓晓,唐艳,邓崇岭,刘冰浩,陈传武,牛英,2018,柑橘不同种属花粉形态观察,果树学报,35(7):794-801.

孔维政,章翼,易自力,黄红梅.基于花粉形态与叶片形态的金柑属种质资源亲缘关系分析[J].分子植物育种,2020,18(12):4083-4096.

基金:长沙市科技计划项目(kh1601170)资助.