彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrida)为天南星科(Araceae)马蹄莲属(Zantedeschia)多年生球根花卉，因品种丰富、色彩艳丽、叶型多样，可作为观赏价值较高的切花、盆花和观叶植物，在国内外花卉市场具有较大发展潜力(张璐萍等,2005;吴红芝等,2008)。彩色马蹄莲原产于南非、埃及等地，中国引进彩色马蹄莲以来，主要集中于开展引种驯化(吴红芝等,2008)、组织培养快繁体系构建(黄衡宇和李鹂,2010)、栽培体系优化(杨柳燕等,2015)、花期调控(张璐萍等,2005)、倍性育种(吴红芝等,2008;李洁筠等,2011)和指纹图谱构建(Wei et al.,2017)等研究工作。与其他球根花卉相比，彩色马蹄莲在花色形成、逆境胁迫响应、种球发育和休眠等方面的分子机理研究还处于起步阶段。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术具有灵敏度高、重复性好、特异性强，且可检测大量样本等优势，广泛应用于基因表达水平分析研究(王世强等,2017;陈敏敏等,2018;刘晓婷等,2018)。然而，qRT-PCR结果的稳定性和准确性受多种因素影响，其中内参基因对其结果起着校正和标准化作用，是影响qRT-PCR结果可靠性的重要因素之一(李健,2017;王世强等,2017;常鹏杰等,2018;陈敏敏等,2018)。近年来，国内外已开展不同物种、品种和组织内参基因筛选工作，总结以往研究结果可知各物种不同品种、不同组织的最佳内参基因存在一定差异(李健,2017;陈敏敏等,2018;刘晓婷等,2018;常鹏杰等,2018)。以不同组织最适内参基因为例，胡椒为Histone 3-1和Polyubiquitin 1(胡丽松等,2017)；朱顶红为GAPHD和E-F1α(刘晓婷等,2018)；百合为bHLH、EIF和EF1(陈敏敏等,2018)；玉兰为GBP、UBQ和UBQ(常鹏杰等,2018)；芍药为UBQ、GAPDH和ACT(李健,2017)。因此，针对试验材料，依据试验目的筛选表达稳定的内参基因，对于基因表达分析结果的稳定性和准确性具有重要意义。

目前，百合(陈敏敏等,2018)、玉兰(常鹏杰等,2018)、红花(Liu et al.,2016)、水仙(Li et al.,2018)、荷花(王彦杰等,2017)等花卉均筛选出最适内参基因，以用于开展生长发育、花色形成、花期调控、逆境响应和衰老等机理研究，然而目前尚未有彩色马蹄莲相关内参基因筛选的研究报道。随着转录组测序技术的成熟和测试成本的降低，先后有多个彩色马蹄莲转录组测序的报道(Candido et al.,2014;Wei et al.,2016;雷霆,2017)，并基于转录组数据分别开展花青素苷合成(雷霆,2017)、病害发生、激素信号转导和代谢途径(Candido et al.,2014)的相关基因挖掘，以及E ST-SSR标记的挖掘(Wei et al.,2016)；但以上研究均未开展功能基因验证工作。因此，本研究基于课题组前期完成的2个彩色马蹄莲育成品种(‘金丝绒’和‘梦幻’)的转录组测序数据，参考预测编码蛋白框(coding DNA sequence,CDS)数据信息，设计6个候选内参基因(18S rRNA,ACT,EF1α,GAPDH,LEU和TUB)对应引物并对其目标片段进行了克隆和验证，利用qRT-PCR技术分析6个内参基因在彩色马蹄莲不同品种和不同组织中的表达量，通过geNorm、NormFinder和BestKeeper对其稳定性评价，以期筛选出在彩色马蹄莲不同品种和不同组织中表达较为稳定的内参基因，为后期开展彩色马蹄莲花色形成、生长发育和代谢机理等研究工作提供参考依据。

1、结果与分析

1.1内参基因扩增片段克隆和特异性分析

以‘首领’叶片的cDNA为模板，6个内参基因经扩增后均获得清晰且明亮的单一的条带。为了进一步明确彩色马蹄莲6个内参基因引物的可靠性，分析6个内参基因的扩增片段与其他植物的蛋白序列进化关系(图1)。结果显示：彩色马蹄莲6个内参基因与其他物种的同源性较高，其中ZhACT的同源性最高，其扩增片段对应的蛋白序列与欧洲油菜(Brassica napus)、晚香玉(Polianthes tuberosa)、蜡烛果(Aegiceras corniculatum)、洋葱(Allium cepa)等完全一致。ZhGAPDH与胡桃(Juglans regia)、川桑(Morus notabilis)、木薯(Manihot esculenta)等多个物种同源性较高；ZhLEU与黄瓜(Cucumis sativus)、高粱(Sorghum bicolor)、油棕(Elaeis guineensis)等多个物种同源性较高；而ZhTUB则与红车轴草(Trifolium pratense)、莴苣(Lactuca sativa)、黄花蒿(Artemisia annua)等多个不同物种同源性较高；Zh18S rRNA则与海枣(Phoenix dactylifera)和猕猴桃(Actinidia chinensis)同源性较高；ZhE-F1α则与毛果杨(Populus trichocarpa)同源性高。因此，基于彩色马蹄莲转录组中CDS序列设计的6个内参基因的引物满足qRT-PCR分析要求。此外，彩色马蹄莲不同品种和不同组织的qRT-PCR的6个内参基因熔解曲线均仅有单一信号峰，无杂峰和非特异性扩增现象，表明6个内参基因qRT-PCR结果准确性较高。

1.2内参基因的表达丰度分析

基于已验证过的引物进行qRT-PCR分析，通过Ct值评估6个候选内参基因在彩色马蹄莲不同品种、不同组织中的表达丰度。由于Ct值与表达丰度呈负相关，即Ct值越小则表达丰度越大。彩色马蹄莲6个内参基因的Ct值在16.02～33.97间，其中EF1α的最小值和最大值均低于其余5个内参基因，表明其表达丰度最大。GAPDH基因最大和最小Ct差值较大，说明其表达差异较大，表达相对不稳定，而18S r RNA、ACT、EF1α和TUB基因Ct差值相对较小，说明其表达差异较小，表达相对稳定。

图1 6个内参基因PCR产物对应蛋白的系统进化树

在彩色马蹄莲7个不同的品种中，6个候选内参基因Ct值在17.74～26.36之间(图3)，其中18S rRNA的Ct平均值最大，其表达丰度最低；EF1α的Ct平均值最小，其表达丰度最高。在马蹄莲‘首领’的不同组织中，6个候选内参基因的Ct值在16.02～33.97之间(图4)，其中EF1α的Ct值最小，其表达丰度最高。由此可见，在彩色马蹄莲不同品种和不同组织中，EF1α的Ct平均值均最小，均具有较高的表达丰度。

1.4内参基因的表达稳定性评价

1.4.1 GeNorm软件分析

经ge Norm软件计算得到的表达稳定值(M值)越小(M值始终≤1.5)，则该内参基因稳定性越高。通过geNorm软件对候选内参基因在7个彩色马蹄莲品种‘慕拉’、‘桑达’、‘行为’、‘首领’、‘刀锋’、‘菲戈’、‘玛雷诺’的叶片和‘首领’品种的根、佛焰苞、茎段、球茎、肉穗、叶6个不同组织表达稳定性进行分析(表1)。在不同彩色马蹄莲品种中，6个候选内参基因的表达稳定性存在显著差异，其M值从小到大依次为EF1α=LEU<18S rRNA

图2 6个内参基因在不同品种和组织中的最值

表1 GeNorm软件分析6个内参基因表达稳定性

图3 6个内参基因在不同品种中的Ct平均值

图4 6个内参基因在不同组织中的Ct平均值

通过geNorm软件计算彩色马蹄莲不同品种和组织的配对变异值(Vn/n+1)，用于确定其最佳内参基因的数目。geNorm软件的设定的默认值为0.15，当配对变异值(Vn/n+1)<0.15时，最适内参基因数目为n个，当Vn/n+1>0.15时，最适内参基因数目为n+1个。对于彩色马蹄莲不同品种，仅V4/5小于0.15，表明彩色马蹄莲不同品种的最适内参基因数为3个；对于彩色马蹄莲的不同组织，V2/3、V3/4、V5/6均大于0.15，则其最适内参基因数也至少为3个。

1.4.2 NormFinder软件分析

通过NormFinder软件计算内参基因的表达稳定值M,NormFinder与ge Norm软件相似，即表达稳定值M越小，表明基因表达越稳定，越适合作为内参基因。经NormFinder软件分析(表2),6个内参基因在彩色马蹄莲不同品种中的M值由小到大排序依次为：18S rRNA

图5 6个内参基因配对变异值

表2 NormFinder软件分析6个内参基因表达稳定性

1.4.3 BestKeeper软件分析

基于BestKeeper软件可计算内参基因的标准偏差(SD)和变异系数(CV),SD(<1)和CV越小，内参基因表达稳定性越好。6个内参基因的SD和CV值显示(表3)，在彩色马蹄莲不同品种中，LEU和TUB的SD值和CV值最小，表明这两个基因的表达较稳定；而ACT和EF1α的SD值大于1且CV值最大，这两个基因不适合作内参基因，在彩色马蹄莲不同组织中，6个候选内参基因的SD值均大于1，表明其均不适合作为内参基因。

1.4.4内参基因稳定性综合评价

经geNorm软件分析，彩色马蹄莲不同品种和不同组织的最适内参基因数均为3个，结合上述3个软件分析结果(表4)，对于彩色马蹄莲不同品种而言，geNorm分析得出较稳定的基因有EF1α和LEU,NormFinder分析得出较稳定的基因有18S rRNA和GAPDH,BestKeeper分析得出较稳定的基因有LEU和TUB，综上最适合的内参基因是18S rRNA、LEU和GAPDH。对于彩色马蹄莲不同组织而言，ge Norm分析得出最稳定的基因有ACT、18S rRNA和EF1α，NormFinder分析得出较稳定的基因有ACT和18S rRNA,BestKeeper结果显示6个内参基因稳定性均不佳，因此综合geNorm和NormFinder软件的分析结果最适合的内参基因是ACT、18S rRNA和EF1α。

表3 BestKeeper软件分析6个内参基因表达稳定性

表4 6个内参基因综合排名

2、讨论

为深入研究球根花卉生长发育、花色形成、花期调控、逆境响应和衰老等机理，国内外已开展朱顶红(刘晓婷等,2018)、百合(陈敏敏等,2018)、玉兰(常鹏杰等,2018)、水仙(Li et al.,2018)、荷花(王彦杰等,2017)、鸢尾(马璐琳等,2019)等花卉的不同品种、组织、发育期、处理的内参基因筛选；然而研究结果表明，不同物种、组织、处理的最佳内参基因存在差异。本研究基于课题组2个彩色马蹄莲转录组数据中CDS信息，设计了6个内参基因(18S rRNA,ACT,EF-1α,GAPDH,LEU和TUB)引物，通过对扩增片段的凝胶电泳检测、扩增片段序列对应蛋白的同源性分析，确认了6个内参基因引物的可靠性。随后，运用qRT-PCR技术结合geNorm、NormFinder和BestKeeper3个软件对6个内参基因表达稳定性进行分析，以筛选彩色马蹄莲不同品种、不同组织的最佳内参基因。

近年来，彩色马蹄莲因其丰富的形态而备受市场欢迎，其品种选育主要以不同色系的新品种为主。然而，彩色马蹄莲也是较好的观叶花卉，其叶片形态、叶耳有无、叶耳长度、表面斑点有无、斑点大小和数量、叶片边缘波状程度等性状各异，增加了其观赏价值(杨柳燕,2013)。彩色马蹄莲叶型主要为戟形、披针形、三角形、卵型，不同品种间叶耳、表面斑点、叶片边缘波状程度存在一定差异(杨柳燕,2013)。本试验使用彩色马蹄莲品种的叶型、叶耳、表面斑点、叶片边缘波状程度不同，筛选不同品种叶片的最佳内参基因，可为后续叶片性状的研究提供基础。基于geNorm软件分析结果，彩色马蹄莲不同品种的最适内参基因数均为3个，ge Norm筛选出排名前3的内参基因为EF1α、LEU和18S rRNA,NormFinder为18S r RNA、GAPDH和TUB,BestKeeper为LEU、TUB和GAPDH；虽然3个软件的最佳内参基因存在一定差异，但18S rRNA和LEU均在2个分析结果中排名前2，表明这2个内参基因稳定性最佳，综合3个软件结果可选择18S rRNA、LEU和GAPDH作为彩色马蹄莲不同品种的内参基因。在彩色马蹄莲切花、盆花生产过程中，通过温度、赤霉素、光照等措施对其花期精准调控已有大量研究(张璐萍等,2005)。然而，不同彩色马蹄莲对外源赤霉素的敏感性不同，且其对栽培环境、外源激素等的响应机理尚未得到充分关注。因此，筛选彩色马蹄莲不同组织的最佳内参基因，可用于深入研究彩色马蹄莲对栽培环境和激素的响应机理，从而指导优化栽培和激素处理措施。对于彩色马蹄莲的不同组织，其最适的内参基因数目也为3个，除了BestKeeper软件分析结果显示6个候选内参基因均不适合以外，geNorm和NormFinder筛选出排名前3的内参基因均为ACT、EF1α和18S rRNA，可见这3个内参基因适宜用于彩色马蹄莲不同组织基因表达分析。本研究中，使用ge Norm、NormFinder和BestKeeper共3个内参基因稳定性分析软件筛选彩色马蹄莲不同品种和组织最佳内参基因，然而3个软件分析筛选的最佳内参基因结果存在一定差异，这与其他物种的研究结果相似，在朱顶红(刘晓婷等,2018)、百合(陈敏敏等,2018)、黄精(王世强等,2017)等不同组织内参基因筛选过程中，也存在软件间分析结果不完全一致情况，这可能由于不同软件的统计原理存在差异所致(Hu et al.,2010;刘晓婷等,2018)。

本试验中经geNorm软件分析，彩色马蹄莲不同品种和组织的最适内参基因数均为3个，综合3个软件的分析结果，18S rRNA、LEU和GAPDH可作为彩色马蹄莲不同品种的内参基因，ACT、EF1α和18S rRNA可作为彩色马蹄莲不同组织的内参基因。本研究结果可为彩色马蹄莲品种间叶片表型差异、种球发育、赤霉素敏感差异等机理研究提供参考依据。

3、材料与方法

3.1试验材料

以上海市农业科学院引进的彩色马蹄莲‘慕拉’(Murad)、‘桑达’(Sanda)、‘行为’(Behavior)、‘首领’(Leader)、‘刀锋’(Blade)、‘菲戈’(Figo)和‘玛雷诺’(Mareno)共7个品种为试验材料，选择直径为5～6 cm的无病害种球种植于上海市农业科学院华漕院区温室大棚，种植方法和栽培管理措施参照杨柳燕等(2015)的方法。采集7个彩色马蹄莲品种(‘慕拉’,‘桑达’,‘行为’,‘刀锋’,‘菲戈’,‘玛雷诺’和‘首领’)的叶片，‘首领’品种的根、佛焰茎、茎段、球茎、肉穗、叶片共6个不同组织，分别称重后液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。

3.2内参基因引物设计

课题组前期通过杂交育种和分子标记辅助选育，获得彩色马蹄莲‘梦幻’(沪农品认花卉2010第003号)和‘金丝绒’(沪农品认花卉2010第004号)2个切花新品种。于2018年委托广州基迪奥生物科技有限公司完成‘梦幻’和‘金丝绒’2个品种的转录组测序，经从头组装后，获取预测编码蛋白框(CDS)数据。基于转录组CDS数据，选择18S rRNA、ACT、EF1α、GAPDH、LEU、TUB共6个基因作为候选内参基因，获取的CDS序列通过NCBI中BlastX(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行比对，选择E值接近零或者为零的序列用于引物设计。按照qRT-PCR引物设计原则，使用Primer Premier 3.0软件参照荧光定量引物设计原则设计引物(表5)，并委托北京擎科新业生物技术有限公司合成相应引物。

3.3总RNA的提取与cDNA第1链的合成

参照Omega(USA)植物总RNA提取试剂盒使用说明书提取彩色马蹄莲不同品种(‘慕拉’,‘桑达’,‘行为’,‘刀锋’,‘菲戈’和‘玛雷诺’叶片)和‘首领’的不同组织(根,佛焰茎,茎段,球茎,肉穗和叶片)的RNA。通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和纯度，使用Nanodrop-2000检测RNA浓度。cDNA第1链的合成参照TIANGEN公司逆转录试剂盒FastQu-ant RT Kit(with g DNase)说明书进行，获得的cDNA保存于-20℃冰箱。

3.4内参基因克隆和分析

使用内参基因中引物(表5)，以‘首领’叶片的cDNA为模板，通过PCR扩增6个内参基因片段。扩增体系为40μL，包括1.1×T3 Super PCR Mix 34μL,cDNA 2μL，上下游引物各2μL(10μmol/L)。扩增程序为：98℃预变性2min;98℃变性10s、58℃退火10s、72℃延伸10 s,35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用DNA回收试剂盒(天根)对目标产物进行回收，回收产物连接至pM-D19-T Vector(宝生物工程有限公司)，转入DH5α感受态细胞后由北京擎科新业生物技术有限公司测序。

表5候选内参基因引物序列

将测序获得的内参基因序列扩增片段在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过BlastX查找同源蛋白序列；使用MEGAX软件进行多重序列比对，通过邻接法构建系统进化树(Bootstrap设为1 000)。

3.5实时荧光定量PCR扩增

试验利用ABI step one plusTM实时荧光定量PCR系统进行。q RT-PCR反应体系为20μL：包括10.0μL qPCR Master Mix(SYBR GreenⅠ)，1.0μL c DNA,0.8μL上下游引物(10μmol/L),ddH2O 7.4μL。反应条件：预变性95℃，1 min；然后95℃10 s,60℃5 s及72℃10 s循环40次。扩增反应结束后利用溶解曲线检测产物特异性，溶解曲线分析从60℃缓慢升温至95℃。

3.6数据处理

通过Excel 2013软件对彩色马蹄莲不同品种和不同组织的q RT-PCR数据整理和汇总；利用内参基因稳定性分析软件(geNorm,NormFinder和BestKeeper)评估不同内参基因的表达稳定性，具体分析步骤和参数设置参照(陈敏敏等,2018;刘晓婷等,2018)。

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基金:上海市现代农业产业技术体系(沪农科产字(2019)第8号);上海市科技兴农成果转化项目(沪农科转字(2016)第2-2号)共同资助.