摘要:以草莓4个品种花粉为试材,研究不同浓度的硼酸、蔗糖以及培养时间、培养温度对其花粉生活力的影响,通过花粉离体萌发法,以筛选花粉萌发最适的固体培养基,并在最优培养基上进一步筛选适合花粉萌发的时间和温度。结果表明,在0.10%硼酸+15%蔗糖+4g/L琼脂培养基下,4个草莓品种花粉萌发率均达到最高;其中,香野花粉萌发率最高,为87.55%,红颜花粉萌发率最低,为72.38%;温度为25℃、处理8h时,4个品种花粉发芽率达到最大。花粉离体萌发法结果准确、花粉粒萌发清晰,是目前最适合测定花粉生活力的一种方法;不同草莓品种其花粉生活力各不相同,选择花粉活力高的品种进行授粉,对草莓杂交育种有着重要意义。
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草莓属蔷薇科多年生雌雄同株草本植物,自花结实率低,生产上一般采用人工授粉或蜜蜂授粉方式提高其坐果率和授粉率[1]。花粉质量的好坏主要是通过花粉活力进行评判,在果树授粉前都会对其父本花粉进行生活力测定[2]。近几年,随着温室大棚蓬勃发展,草莓种植业也快速提升。目前,我国种植的草莓品种基本上都是从美国以及日、韩等国家引进的外来品种,草莓亲本遗传背景狭窄,培育本土优良性状草莓品种显得尤为重要。迄今为止,常规杂交育种仍是我国品种选育的主要途径[3],掌握草莓不同品种花粉特性,是合理配置授粉植株、提高草莓坐果率的重要依据。
目前,对花粉活力的鉴定方法可归纳为染色剂法、电镜形态观察法、萌芽测定法、田间授粉法等[4]。其中,染色剂法根据染色液类别不同,又可分为I2-KI染色法、TTC染色法、MTT染色法、亚历山大染色法、醋酸洋红染色法和苯胺蓝染色等;萌芽测定法包括离体萌发测定法和活体萌发测定法[5]。染色法虽然操作简单,但由于染色液大部分为有毒试剂,且测定结果差异较大,仅适用于田间授粉快速检测;而与染色法相比,花粉离体萌发试验虽然操作复杂,但用该方法测定所得数据科学可靠,是目前杂交育种中花粉生活力测定的常用方法[6]。
本研究采用花粉离体萌发法测定草莓花粉的生活力(通过设计蔗糖浓度梯度为0、5%、10%、15%;硼酸浓度梯度为0、0.10%、0.15%,琼脂浓度为4g/L),对4个品种草莓花粉进行培养,旨在筛选出适合草莓花粉萌发的最优培养基,并进一步探讨不同培养温度和培养时间对花粉活力的影响,为今后草莓杂交授粉及新品种选育提供一定的理论依据。
1、材料和方法
1.1试验材料及处理
选取香野、章姬、圣诞红和红颜4个草莓品种花粉为供试材料,其采自山西农业大学果树研究所草莓大棚。于2020年4月23日至6月4日10:00左右采集大、中花蕾于纸袋中,晾置于温度25℃阴凉通风室内;后用镊子将健康花药剥入硫酸纸折成的小盒,放入干燥器中;待花药自然开裂散粉后,将其收入小瓶中,置于4℃冰箱中贮藏备用。
1.2试验方法
1.2.1草莓花粉数量及畸形花粉率统计
收集草莓中花蕾期花朵,剥取完整健康花药10~20枚,放入干燥的玻璃小瓶中,于干燥器中散粉,待花粉完全散出后,加入1mL蒸馏水充分振荡;用移液管吸取0.1mL花粉水,用蒸馏水稀释至10mL,然后用移液枪吸取4μL花粉水滴于含凹槽载玻片上,在电子显微镜下观察花粉萌发情况,统计花粉粒总数及畸形花粉粒数,重复3次。采用花粉管离体萌发法测定花粉萌发率。
1.2.2草莓花粉萌发最适培养基的筛选
通过设计蔗糖和硼酸不同浓度配比,配置硼酸浓度为0、0.10%、0.15%;蔗糖浓度为0、10%、15%;琼脂浓度为4g/L的固体培养基,每组浓度梯度重复6次。使用前可用微波炉将培养基加热融化后,吸取100μL培养基于凹面载玻片上,待凝固后用解剖针挑取少量花粉均匀散播在培养基上;将载玻片放入铺有湿纱布的培养皿中,将培养皿放到带盖的手术盘中,置于25℃恒温培养箱暗培养5h以上,在电子显微镜下观察花粉萌发情况,统计花粉萌发率。
1.2.3草莓花粉萌发最佳时间的筛选
为进一步研究培养时间对花粉萌发的影响,试验设置0、2、4、6、8、10h时间梯度,用解剖针挑取适量花粉均匀散播在花粉萌发培养基(0.10%硼酸+15%蔗糖+4g/L琼脂)上,置于25℃恒温培养箱暗培养,每次处理重复3次,在电子显微镜下观察花粉萌发状况,统计花粉萌发率。
1.2.4草莓花粉萌发最佳温度的筛选
试验从低温到高温设置6个温度梯度,分别为5、10、15、25、35、45℃。将花粉均匀撒播在0.10%硼酸+15%蔗糖+4g/L琼脂培养基上,置于恒温培养箱暗培养,每次处理重复3次;培养6~8h后放到显微镜下观察花粉萌发情况,并统计花粉萌发率。
1.3数据分析
采用Excel2003对试验数据进行处理,计算平均值和标准偏差,绘制图表;采用SPSS软件进行单因素方差分析、Duncan多重比较,检验草莓不同品种花粉萌发率的差异(在α=0.05/0.01水平上进行比较),6次重复。
2、结果与分析
2.1花粉数量及畸形花粉率分析
从表1可以看出,香野、章姬、圣诞红和红颜每枚花药中的花粉数量分别为20267、26467、25133、10933粒;正常花粉数分别为17100、20200、17600、7000粒;4个品种的畸形花粉率除章姬和圣诞红差异不显著,香野和红颜差异极显著,畸形花粉率从高到低依次为红颜>圣诞红>章姬>香野,香野畸形花粉最少,畸形花粉率为15.74%,红颜畸形花粉数最多,畸形花粉率为36.27%。
表1不同草莓品种畸形花粉率分析
2.2花粉最适培养基的筛选
从表2可以看出,4个品种花粉萌发率随蔗糖和硼酸浓度的增加呈先升后降的趋势;当培养基的蔗糖浓度为15%和硼酸浓度为0.10%时,花粉萌发率达到最高;其中,香野的花粉在此培养基萌发率最高,为87.55%,显著高于红颜花粉萌发率(72.38%);圣诞红、章姬花粉萌发率分别为83.05%、83.50%,二者差异不显著;当培养基蔗糖浓度为15%不变、硼酸浓度上升为0.15%时,花粉萌发率有所下降,圣诞红、章姬、香野和红颜萌发率分别为74.87%、68.04%、77.82%和62.66%,其大小表现为香野>圣诞红>章姬>红颜。因此,0.10%硼酸+15%蔗糖+4g/L琼脂为草莓花粉萌发的最适培养基。
表2不同培养基类型的花粉萌发率分析
2.3花粉萌发最佳时间的筛选
从表3可以看出,不同培养时间对草莓萌发率有一定的影响,在4~8h时,随时间上升4个草莓品种萌发率逐渐升高,在8h萌发率达到最高;香野萌发率最高,在8h花粉萌发率为88.54%;红颜花粉萌发率最低,8h花粉萌发率仅为52.14%,极显著低于其他3个品种。当培养时间超过8h时,4个品种的花粉萌发率均开始下降,而红颜的花粉萌发率继续增加,说明并不一定是培养时间越长花粉萌发率越高。因此,草莓花粉在0.10%硼酸+15%蔗糖+4g/L琼脂的培养基上培养8h为花粉萌发的最佳时间。
表3不同培养时间的花粉萌发率分析
2.4花粉萌发最佳温度的筛选
由表4可知,不同培养温度对草莓萌发率有很大的影响,随培养温度升高4个草莓品种花粉萌发率呈先升高后下降的抛物线趋势,在25℃培养8h萌发率最高;其中,香野花粉萌发率最高,为87.50%,高于其他培养温度;圣诞红和章姬花粉萌发率分别为81.24%和82.49%,二者差异不显著;红颜萌发率最低,为66.53%。当温度升高到45℃时,香野仍有少量花粉萌发,但萌发率仅为1.01%,其余3个品种几乎未萌发,红颜萌发率为0。因此,低温和高温均不利于草莓花粉萌发,25℃为4个品种花粉萌发的最适温度。
表4不同培养温度的花粉萌发率分析
3、结论与讨论
大量研究表明,花粉活力大小很大程度上受到花粉萌发率高低的制约,花粉萌发率越高,花粉活力越好,授粉后果实的坐果率、果实品质及杂交授粉成功率越高。草莓畸形果及杂交率低很大程度是由于花粉活力太差。不同植物花粉萌发所需培养条件各不相同,不仅受自身发育状况的影响,也受培养基成分、温度、培养时间等的影响[7],当培养基蔗糖和硼酸浓度适宜时,花粉萌发率达到最高且利于花粉管伸长。蔗糖是花粉萌发和花粉管生长的营养来源,同时又为花粉代谢和跨膜运输提供能量[8]。但过高的蔗糖浓度又会导致花粉萌发率降低甚至不萌发。曾祥久[9]对银杏花粉培养基优化时发现,蔗糖质量浓度为50~100g/L时,花粉萌发率最高;当质量浓度达到150~200g/L时萌发率不升反降;宋艳荣[10]对苹果花粉离体培养时发现,蔗糖浓度控制在5%~15%范围内,有利于4种苹果花粉的萌发;当蔗糖浓度大于10%时,则不利于其花粉萌发。本试验结果发现,蔗糖浓度维持在10%~15%时最适草莓花粉萌发;当浓度超过15%时,萌发率降低。此外,花粉离体培养基离不开硼酸的作用,硼不仅是植物生长所需元素,也是花粉萌发不可或缺的元素,培养基如果缺少硼会导致花粉萌发过缓、花粉管生长缓慢甚至抑制其生长[11]。在花粉萌发过程中,硼酸能促进花粉对能源物质的吸收和利用,所以适宜浓度的硼酸也有利于花粉的萌发[12]。在本试验中,硼酸浓度为0.10%时,4个草莓花粉萌发率达到最大值,其他浓度下其萌发率差异不显著;当硼酸浓度超过0.15%时,花粉萌发率降低。也有研究表明,一定浓度的CaCl2对花粉萌发具有促进作用[13]。张瑞等[14]在对薄壳山核桃花粉研究时发现,Ca2+是花粉管极性生长不可缺少的物质,而花粉管尖端是Ca2+集中分布区域,外源给予一定浓度的钙源能促进花粉管伸长。在今后的试验中也可尝试在培养基中加入适量的CaCl2,以达到花粉萌发的最佳效果。
此外,花粉活力也会受到温度的影响,温度与花粉活力呈负相关[15]。杜纪红等[16]研究发现,一般花粉贮藏温度越低寿命越长,当外界温度升高时花粉内部呼吸强度变大,使其代谢旺盛、水分流失、营养物质耗损、酶活性减弱、产生有害次生代谢产物,这些都会加快花粉的衰老与死亡。庞夫花等[17]对草莓新品种宁玉的花粉特性研究发现,宁玉花粉在温度达到45℃时仍有萌发,而红颜在45℃时已不萌发。本研究中,只有香野草莓在45℃下有少量花粉萌发,萌发率仅为1.01%,其他3个品种几乎未萌发;当温度处于25℃时,4个品种草莓均达到最高萌发率,与王壮伟等[18]对丰香草莓花粉的研究结果一致。
不同品种花粉萌发时间也略有不同,草莓相对于桃、杏、李等蔷薇科果树花粉萌发慢,薛晓敏等[19]对李花粉萌发时间筛选发现,李花粉萌发快,2h下花粉萌发即可满足授粉需求;王壮伟等[18]研究发现,草莓花粉萌发高峰为3h,3~5h花粉萌发率趋于稳定;庞夫花等[17]将宁玉花粉培养8h后花粉萌发率达到最高,随着培养时间延长花粉萌发率逐渐下降。本试验中,4个品种花粉萌发率随着培养时间的延长呈先升后降的抛物线曲线,最强萌发时间为8h。
本研究采用准确率较高的离体萌发法测定草莓花粉生活力,结果表明,4个草莓品种花粉萌发率最适的培养基为0.10%硼酸+15%蔗糖+4g/L琼脂,当培养基中蔗糖浓度为15%、硼酸浓度为0.10%~0.15%时花粉萌发率差异不显著;花粉萌发最佳温度为25℃,花粉萌发时间为8h最适宜观察统计。香野具有较强的花粉活力,花粉数量多、畸形花粉率低,这与实际生产上香野草莓果实个大、果实光泽强、果品质量高、畸形果率低等生理现象相符。香野草莓是一个比较容易栽培、经济效益高的优良品种,在育种上可以考虑将其作为父本材料进行授粉,以提高杂交后代的品质和抗性。红颜较其他3个品种花粉萌发率低,畸形花粉数也较多,这与庞夫花等[16]测定红颜花粉萌发率的研究结果相似。尽管生产上红颜草莓已成为国内草莓种植业栽培面积最大的品种,但是由于其抗病性较差,以其作为亲本筛选抗病后代的概率较低。
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基金:晋财教2016草莓高科技育种平台项目(2016-100-1)
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