口腔颌面部肿瘤、炎症及骨折后的骨再生是目前再生医学领域亟待攻克的难题之一。间充质干细胞被认为是骨再生理想的种子细胞[1],其中人牙囊干细胞(human dental follicle stem cells, hDFSCs)因其获取容易、培养简单、伦理争议较小等优势被认为是具有潜力的新型种子细胞[2,3]。但hDFSCs成骨分化的效能尚未达到理想水平，限制了其在骨再生治疗中的应用。因此，提升hDFSCs的成骨分化效能是目前研究的重要目标。

在细胞分化中，药物诱导分化是一种有效的调控方式。一些异黄酮类化合物已被证实能促进干细胞成骨分化。芒柄花素(formononetin)是具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎以及促进成骨等多种药理作用的异黄酮化合物，备受医学研究者们关注[4,5,6]。研究表明，芒柄花素具有类似于雌激素的作用，可促进骨形成并抑制骨吸收[7,8]。然而，芒柄花素能否促进hDFSCs的成骨分化尚不明确。因此，本研究拟探究芒柄花素对hDFSCs的成骨分化的影响，旨在为hDFSCs的成骨诱导分化提供新的研究思路。

1、材料与方法

1.1 材料和试剂

芒柄花素(98%,上海阿拉丁);DMEM高糖培养基、α-MEM培养基、胎牛血清(美国Gibco);0.25 %胰蛋白酶(苏州新赛美);青链霉素混合液(美国HyClone);Actin-tracker Green-488、BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天);CCK-8、TransZol Up(北京全式金);RT-qPCR逆转录试剂盒、SYBR Green Supermix荧光定量试剂盒(上海翌圣);RT-qPCR引物(上海生工);0.2%茜素红S染液(北京索莱宝)。

1.2 hDFSCs分离、培养及鉴定

1.2.1 hDFSCs分离、培养

本研究收集来自吉林大学口腔医院口腔颌面外科10岁左右患儿多生牙拔除术中刮取的牙囊组织(吉林大学口腔医院伦理委员会审批，审批号：JDQ202345)。经患儿家长知情同意后，术中拔除多生牙同时刮取其周围的牙囊组织，迅速转移至装有α-MEM培养基的Ep管内，置于冰盒内转运至超净台中。首先分别用含有10%青链霉素混合液的PBS和α-MEM培养基清洗3次，然后将牙囊组织剪碎至约1 mm2大小并使用Ⅰ型胶原酶(5 mg/mL)消化直至组织变成絮状，最后离心收集细胞悬液并加入α-MEM完全培养基放入细胞培养箱中培养。培养5 d后首次换液，以后每隔2～3 d换液，待细胞长满约80%～90%时传代。选取第3～5代hDFSCs用于后续实验。

1.2.2 表型鉴定

将hDFSCs消化、离心收集细胞，然后加入2 mL冰无水乙醇固定细胞，并以1×106个/管的密度将细胞分装置Ep管内，4 ℃离心，PBS清洗，然后每管加入200 μL抗原封闭液孵育15 min, PBS清洗，使用100 μL PBS重悬，每管分别加入1 μL的FITC anti-human CD34、CD45、CD90、CD105后混匀，避光孵育1 h。PBS清洗2次后重悬，转移至流式管内后在BD流式细胞仪进行检测。

1.2.3 多向分化潜能鉴定

以1×105个细胞/孔的密度将hDFSCs接种至12孔板中，次日更换诱导培养基。(1)成骨潜能：加入成骨诱导培养基(含有10 mmol/L β-Glycerohosphate、10 nmol/L Dexamethasone和50 μg/mL Ascorbic Acid的α-MEM培养基 ),隔日换液，培养至21 d时，先使用多聚甲醛固定，然后使用0.2%茜素红S染液进行染色，最后使用双蒸水清洗残留染液并观察矿化结节拍照。(2)成脂潜能：加入成脂诱导分化培养基，隔日换液，培养至21 d时，多聚甲醛固定后加入油红O染液进行染色，双蒸水清洗残留染液后观察脂滴形成情况并拍照。

1.3 细胞增殖检测

将hDFSCs以2×103个细胞/孔的密度接种至96孔板中，次日更换含有不同浓度芒柄花素(0、0.1、1、10 μmol/L)的培养基，每组设置5个复孔。分别培养1、3、5 d后，弃原培养基，每孔加入含10%的CCK-8的α-MEM培养基的工作液孵育1.5 h, 在450 nm处用酶标仪检测吸光度(A)值并计算细胞相对存活率。弃工作液，加入结晶紫染液进行染色， PBS清洗后用扫描仪拍照观察。

1.4 活/死细胞荧光染色

将hDFSCs以2×104个细胞/孔的密度接种于48孔板中，次日更换为含不同浓度的芒柄花素的α-MEM培养基。培养24 h后，依照Calcein/PI试剂盒说明书进行荧光染色，然后使用倒置荧光显微镜观察拍照。

1.5 细胞骨架荧光染色

按照1.4所述方法接种细胞并更换培养液，培养24 h后， PBS清洗后固定， 0.1%Triton X-100漂洗，每孔加入稀释浓度为1∶200的Actin-tracker Green-488避光孵育45 min。0.1%Triton X-100彻底漂洗2次，每次5 min, 每孔加入DAPI并用锡纸遮盖48孔板，孵育5 min, PBS漂洗后使用倒置荧光显微镜观察拍照。

1.6 RT-qPCR实验

将hDFSCs以2×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，次日更换为含不同浓度芒柄花素的成骨诱导培养基诱导7、14 d后，按照TransZol Up说明书提取总RNA,使用RT-qPCR逆转录试剂盒逆转录成cDNA,最后按照SYBR Green Supermix荧光染料说明书配置反应体系，以GADPH为内参，使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行RT-qPCR反应，检测Runx2、OCN和Col-Iα1 mRNA表达的变化。各引物序列如表1所示。

图1 hDFSCs的培养及鉴定(×400)   

表1 RT-qPCR 引物序列

1.7 碱性磷酸酶染色及活性测定

按照1.2.3所述密度接种hDFSCs于12孔板，次日更换含不同浓度芒柄花素的成骨诱导培养基培养7、14 d后，按照BCIP/NBT ALP染色试剂盒和ALP活性定量试剂盒说明书进行ALP染色和ALP活性的测定。

1.8 茜素红染色

按照1.2.3所述密度接种hDFSCs于12孔板，次日更换含不同浓度芒柄花素的成骨诱导培养基培养21 d, 按照1.2.3所述染色步骤进行茜苏红染色。每孔加入10%氯化十六烷基吡啶溶解被染色的矿化结节并转移至96孔板中，在562 nm处用酶标仪检测A值。

1.9 统计学分析

所有实验独立重复3次，运用SPSS软件(MAC OS版本 22.00)对数据进行统计分析，通过One-Way ANOVA分析比较组间差异， 以P<0.05为组间差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 hDFSCs的培养及鉴定

原代培养第5天可见hDFSCs从组织块中爬出，呈长梭形(图1a),第3代hDFSCs细胞集落呈旋涡状(图1b)。成骨化诱导培养后，结果(图1c)显示hDFSCs内可见大小不一的橙红色钙结节；成脂化诱导培养后，结果(图1d)显示hDFSCs中可见明显细小脂泡堆积。流式细胞术结果显示，所获hDFSCs的CD90、CD105呈阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达。CD90和CD105阳性表达率分别为99.68%和96.69%,CD34和CD45阳性表达率分别为0.46%和0.44%。综上表明本研究已成功提取hDFSCs。

2.2 芒柄花素对hDFSCs增殖的影响

由CCK-8结果(表2)可见，培养1、3、5 d后芒柄花素各浓度组与空白组相比对hDFSCs的增长均没有明显的细胞毒性作用。结晶紫染色结果(图2)显示，芒柄花素各浓度组与空白组相比细胞数量没有明显变化。CCK-8结果和结晶紫染色结果相符合。为了进一步验证不同浓度组的芒柄花素对hDFSCs是否产生毒性，进行了活/死细胞染色，结果如图3所示，芒柄花素各浓度组中死细胞较空白组相比未见明显增多，不同浓度的芒柄花素对hDFSCs无明显的毒性。

表2 1、3、5 d芒柄花素各组细胞存活结果

图2 1、3、5 d后芒柄花素各组结晶紫染色结果(×40)   

2.3 芒柄花素对hDFSCs细胞骨架形态影响

如图4所示，各组hDFSCs内可观察到挺直的应力纤维和丝状的伪足结构。与空白组相比，芒柄花素处理后的hDFSCs内应力纤维和伪足结构明显；细胞由长梭形变为多边形，细胞向各方向移动的趋势明显。

图3 芒柄花素各组活/死细胞染色荧光染色情况(×100)   

图4 芒柄花素各组细胞骨架荧光染色情况(×100)   

2.4 芒柄花素对hDFSCs的成骨标志基因表达的影响

如表3所示，7 d时，1 μmol/L芒柄花素组相比于空白组的Runx2和Col-Iα1的mRNA表达显著上调。14 d时1 μmol/L芒柄花素组相比于空白组的OCN、Runx2和Col-Iα1的mRNA表达显著上调。上述结果表明，1 μmol/L芒柄花素可上调成骨标志基因Runx2、OCN和Col-Iα1的mRNA表达。

2.5 芒柄花素对hDFSCs ALP活性的影响

ALP染色结果(图5) 表明，7 d时各浓度芒柄花素组间染色深度无显著差异。而14 d时1 μmol/L芒柄花素组染色最深，其余浓度组也较空白组深。ALP活性测量结果(表4)显示，7 d时1 μmol/L芒柄花素组ALP活性显著增加。14 d时各浓度芒柄花素组ALP活性均有提升，尤其是1 μmol/L芒柄花素组最高。

表3 hDFSCs成骨诱导7、14 d后成骨标志基因表达水平

图5 成骨诱导7、14 d后碱性磷酸酶表达情况(×200)   

表4 成骨诱导7、14 d后碱性磷酸酶活性定量分析

2.6 芒柄花素对hDFSCs矿化沉积的影响

茜苏红染色结果(图6)表明，21 d时各浓度芒柄花素组与空白组相比，钙结节的形成数量比较明显。茜苏红定量分析结果(表5)显示：与空白组相比，1 μmol/L芒柄花素组处理后钙结节数量数量较多，与染色结果一致。

表5 成骨诱导21 d后钙化结节定量分析

3、讨论

口腔颌面部牙槽骨缺损修复是再生医学中亟待解决的问题[9],以干细胞移植为主的细胞疗法是目前研究的热点之一[10]。hDFSCs因取材过程中不会对患者造成二次损伤、免疫排斥反应较低等优势[11],已成为干细胞移植疗法中极具潜力的种子细胞。本研究通过流式细胞术对提取的hDFSCs进行表型检测，结果显示CD34、CD45阳性表达小于1.0%,CD90、CD105阳性表达大于95 %;且在成骨诱导和成脂诱导下可分化为成骨细胞和脂肪细胞，证明了本研究已成功提取hDFSCs。

图6 成骨诱导21 d后各组茜苏红染色结果(×200)   

干细胞定向诱导分化是干细胞移植疗法的关键因素。采用天然产物诱导干细胞定向分化是极具应用潜力的方法。芒柄花素作为一种4’端带有一个甲氧基的异黄酮化合物(图7),具有雌激素活性和高生物安全性，被广泛用作抗肿瘤、抗氧化的药物[12]。研究显示芒柄花素可通过提高大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞中ALP活性，发挥骨保护作用[5,6]。但关于芒柄花素是否刺激hDFSCs的成骨分化未有明确答案，所以，本研究选用不同浓度的芒柄花素作用于hDFSCs, 研究其对hDFSCs成骨分化的影响。CCK-8、结晶紫染色、活/死细胞染色和细胞骨架荧光染色结果显示所选浓度范围内的芒柄花素对hDFSCs增殖和迁移无明显抑制作用。

图7 芒柄花素分子式  

ALP与成骨分化早期细胞外基质的产生关系紧密，是细胞外基质矿化的必要条件之一[13],也是成骨分化早期的标志物[14]。本研究分别在成骨诱导7、14 d后检测ALP活性及ALP染色蓝染深度，我们发现成骨诱导7 d时各组ALP蓝染深度大致相同，但1 μmol/L芒柄花素组细胞的ALP活性高于空白组。而成骨诱导14 d时各芒柄花素浓度组ALP活性和蓝染深度均高于空白组，特别是1 μmol/L芒柄花素组细胞的ALP活性和蓝染深度最为显著。提示1 μmol/L浓度的芒柄花素能够提高hDFSCs碱性磷酸酶表达。矿化结节的形成是成骨分化晚期的一个重要现象。在本研究中，我们通过茜素红染液对矿化结节进行染色并对其进行半定量分析，评估芒柄花素对hDFSCs成骨过程中矿化结节形成的影响。结果显示，1 μmol/L芒柄花素组的细胞矿化结节形成多于空白组，进一步验证了1 μmol/L浓度的芒柄花素对于hDFSCs成骨分化的增强作用比较明显。

Runx2在成骨分化过程中扮演着“关键先生”的角色，发挥着至关重要的作用[15]。激活后的Runx2在成骨分化早期上调Col-Iα1的表达，并使细胞产生细胞外基质；而在成骨分化晚期Runx2上调OCN基因的表达，促进基质矿化的沉积[13]。本研究结果显示，成骨诱导14 d, 1 μmol/L芒柄花素组OCN、Runx2和Col-Iα1的mRNA的表达量高于空白组。再次验证了1 μmol/L浓度芒柄花素上调hDFSCs成骨相关基因的表达比较显著。成骨诱导7 d时1 μmol/L芒柄花素组Runx2和Col-Iα1的mRNA的表达量高于空白组，但OCN的mRNA表达量与空白组相比没有显著变化。说明OCN是成骨分化晚期的一个重要的检测指标[16]。Runx2的上调与Wnt/β-catenin途径的调控作用息息相关，这是由于Runx2是Wnt/β-catenin下游途径中一个关键的靶点基因[17,18],因此，我们推测芒柄花素可能通过Wnt/β-catenin信号通路的激活上调Runx2、Col-Iα1和OCN基因的表达，从而加速hDFSCs成骨分化，但相关结论仍需进一步研究。

综上所述，本实验证实1 μmol/L的芒柄花素能通过上调Runx2、Col-Iα1和OCN基因的表达促进hDFSCs的成骨分化，这可能与Wnt/β-catenin下游途径的激活相关，还需要未来进一步验证。为芒柄花素在干细胞治疗中的应用奠定了理论基础。

参考文献:

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基金资助:吉林省科技发展计划项目(编号:20230204079YY);

文章来源:陶天翼,李正强,郑晓雪等.芒柄花素促进牙囊干细胞成骨向分化[J].口腔医学研究,2024,40(03):214-220.