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水飞蓟提取物及复合制剂对乙醇中毒小鼠肝的保护作用

2024-04-14 8 上传者：管理员

摘要：目的探究水飞蓟提取物(SME)及其复合制剂对乙醇性肝损伤的保护作用。方法通过灌胃12 mL·kg-1 50%乙醇建立乙醇肝损伤模型。将小鼠随机分为空白组(给予蒸馏水)、模型组(乙醇肝损伤模型)、SME低和高剂量组(分别给予0.06、0.20 g·kg-1 SME)、SME+灵芝提取物(GLE)低和高剂量组(分别给予0.10、0.30 g·kg-1 SME+GLE,SME∶GLE=1∶1)、水飞蓟丹参片(JAS)低和高剂量组(分别给予0.68、2.04 g·kg-1JAS),每组12只。用全自动生化分析仪测定法测定小鼠血清中谷丙转氨酶(GPT),用酶联免疫吸附试验法测定小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平，用紫外分光光度计测定肝组织氧化应激指标[过氧化氢酶(CAT)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)]。结果空白组、模型组、SME低和高剂量组、SME+GLE低和高剂量组、JAS低和高剂量组的T-SOD含量分别为(192.54±49.00)、(141.65±34.72)、(205.83±32.77)、(191.68±25.83)、(192.31±28.79)、(177.82±32.61)、(218.58±74.80)和(210.24±31.65) U·mg·prot-1,CAT含量分别为(37.78±5.73)、(28.92±8.44)、(44.12±11.52)、(41.41±9.15)、(47.01±10.48)、(41.63±8.95)、(47.14±8.91)和(48.29±10.06) U·mg-1,GPT含量分别为(47.61±13.00)、(97.84±26.00)、(62.33±18.92)、(51.84±17.91)、(70.77±28.00)、(58.00±21.27)、(52.28±18.78)和(45.55±9.27) U·L-1,IL-6水平分别为(21.03±1.52)、(28.43±5.75)、(21.90±3.24)、(21.23±1.55)、(22.26±2.58)、(21.24±2.91)、(22.17±4.14)和(21.14±3.02) pg·mL-1;模型组的上述指标与空白组比较，SME组、SME+GLE组和JAS低、高剂量组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。空白组、模型组、SME低和高剂量组、SME+GLE低和高剂量组、JAS低和高剂量组的TNF-α水平分别为(28.07±7.72)、(69.02±16.34)、(40.29±8.94)、(48.84±10.17)、(41.91±14.96)、(40.07±12.75)、(50.72±11.44)和(45.05±11.34) pg·mL-1。模型组与空白组比较，SME低和高剂量组、SME+GLE低和高剂量组、JAS低剂量组与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 SME及其复合制剂可以提高小鼠肝的抗氧化水平、减轻小鼠肝的炎症，对于急性乙醇中毒导致的肝损伤具有一定的改善作用。

关键词：
ALD
抗氧化能力
护肝
水飞蓟提取物
炎性因子
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乙醇性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是一种由乙醇滥用引起的复杂疾病，根据世界卫生组织的调查数据显示，在我国其发病率和死亡率呈上升趋势[1]。水飞蓟可以减轻氧化应激和由此产生的细胞毒性，从而保护肝细胞[2]。灵芝提取物(ganoderma lucidum extract, GLE)通过促进肝核酸、蛋白质的合成，以及提高肝细胞色素P-450的含量来为乙醇性肝损伤提供保护[3]。水飞蓟葛根丹参片(Jian An Shi Silymarin Pueraria Mirifica and Tansy tablets, JAS)是水飞蓟、葛根和丹参等植物提取物。因此将水飞蓟、灵芝和丹参提取物结合使用，可以发挥协同作用，有效改善肝功能和减缓肝纤维化，防止乙醇性肝损伤的发生和发展。本研究以水飞蓟提取物(silybum marianum extract, SME)及其复合制剂为研究对象，探究其对急性乙醇性肝损伤的保护作用及可能的作用机制。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性SPF级小鼠，鼠龄8周，体质量(20±2) g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0008。本实验经北京联合大学应用文理学院保健食品检测中心实验动物伦理审查委员会批准(伦理批号：20211201)。

药品与试剂JAS,规格：每片1.02 g,批号：202103R,批准文号：国食健注G20190121,汤臣倍健股份有限公司生产；SME,含量：>93%,批号：Y211002-A,购自北京信达和众国际贸易有限公司；GLE,含量：>95%,批号：Y211002-A,广东青云山药业有限公司生产。谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)试剂盒、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)试剂盒，均由中生北控生物科技股份有限公司生产；白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒，均由上海酶联生物科技有限公司生产；过氧化氢酶(catalase, CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)试剂盒，均由南京建成生物工程研究所生产。

仪器AU480全自动生化分析仪，美国BECKMAN公司产品；SPARKBR680酶标仪，德国TECAN公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

SME的人体推荐的剂量为0.39 g·d-1,SME+GLE中SME和GLE的比例是1∶1,人体推荐剂量0.60 g·d-1,JAS的人体推荐剂量4.08 g·d-1,实验设人体推荐量的10倍、30倍分别为样品的低剂量、高剂量。

称取各药品适量，加入无菌水配制成不同质量浓度的溶液。SME的质量浓度分别为6、20 mg·mL-1;SME+GLE的质量浓度分别为10、30 mg·mL-1(SME、GLE的比例是1∶1);JAS的质量浓度分别为68、204 mg·mL-1。

2.2 模型构建[4]4]、动物分组与给药方法

将小鼠随机分为空白组(蒸馏水)、模型组(蒸馏水)、SME低和高剂量组(6、20 mg·mL-1SME)、SME+GLE低和高剂量组(10、30 mg·mL-1SME+GLE,SME∶GLE=1∶1)、JAS低和高剂量组(68、204 mg·mL-1 JAS),每组12只。各组均每日灌胃1次受试物，小鼠灌胃体积为10 mL·kg-1,连续给药28 d。第29天，空白组小鼠灌胃给予0.9%NaCl,其余组小鼠每隔12 h灌胃给予50%乙醇(12 mL·kg-1),连续3次，建立乙醇肝损伤模型。

2.3 小鼠体质量和脏器系数的测定

实验开始前和结束后测量小鼠体质量。实验结束后对小鼠进行脱颈处死，保留肝组织，立即用预冷0.9%NaCl漂洗并用滤纸吸干后称质量并计算脏器系数。

2.4 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色法观察小鼠肝组织切片[5]5]

切取肝组织各1块，经乙醇、二甲苯脱水透明，石蜡包埋，制成5μm厚度切片，进行HE染色，用光学显微镜观察、拍照。

2.5 全自动生化分析仪测定小鼠血清中转氨酶水平[6]6]

取小鼠眼眶血，在4℃下，以3 000 r·min-1离心20 min,分离血清，血清样品置于-80℃冰箱中保存待测。参照试剂盒说明书，分别测定血清中GPT和GOT的含量。

2.6 ELASA法测定小鼠血清中的炎性细胞因子的水平[7]7]

取小鼠眼眶血，在4℃下，以3 000 r·min-1离心20 min,分离血清，血清样品置于-80℃冰箱中保存待测。参照ELASA试剂盒说明书，用ELASA法测定小鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。

2.7 紫外分光光度计测定小鼠肝中抗氧化物质的水平[8]8]

快速称取肝0.1 g,按1∶9体积比添加0.9%NaCl,于冰水浴条件下制成10%组织匀浆，以3 000 r·min-1离心10 min,将匀浆上清液分别稀释为将匀浆上清液稀释为1.0%和0.5%,测定肝组织中T-SOD、CAT水平。

3 统计学处理

用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用单因素方差分析，2组间比较用LSD-t检验。

二、结果

1 SME及其复合制剂对小鼠体质量及脏器系数的影响

空白组给予蒸馏水；模型组建立乙醇肝损伤模型；SME低和高剂量组分别给予0.06、0.20 g·kg-1 SME;SME+GLE低和高剂量组分别给予0.10、0.30 g·kg-1 SME+GLE,SME∶GLE=1∶1;JAS低和高剂量组分别给予0.68、2.04 g·kg-1 JAS。

给药前与给药后，各组小鼠的体质量在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),见表1。这说明小鼠的初始体质量在各组间较为均衡，即SME及其复合制剂对小鼠体质量均无不良影响。

2 SME及其复合制剂对肝组织切片病理学的影响

在空白组中，肝组织结构未见异常。模型组中的肝细胞严重水肿，呈气球样变，可见部分肝细胞小灶状坏死。在SME各剂量组中，肝细胞水肿、气球样变随剂量有所改善，可见个别肝细胞点状坏死。在SME+GLE各剂量组中，肝细胞水肿、气球样变随剂量有明显改善。在JAS各剂量组中，肝细胞水肿、气球样变有明显改善，几乎未见炎细胞浸润现象。HE染色结果显示：SME及其复合制剂对肝组织切片有明显改善，肝细胞结构基本恢复，胞浆内无脂滴出现，表明SME及其复合制剂对乙醇造成的肝损伤具有一定的保护作用，且JAS的改善效果最佳。结果见图1。

表1提取物对小鼠体质量、脏器系数的影响

图1小鼠肝组织切片苏木精-伊红染色结果(×400)

3 SME及复合制剂对血液中转氨酶的影响

模型组与空白组比较，GPT、GOT含量均显著升高(均P<0.01);SME高、低剂量组和JAS高剂量组与模型组比较，GOT含量均显著降低(均P<0.01);SME、SME+GLE和JAS高、低剂量组与模型组相比，GPT含量均显著降低(均P<0.01),见表2。

4 SME及复合制剂对血清中炎性细胞因子水平的影响

如表3所示，模型组与空白组相比，IL-6和TNF-α水平均显著升高(均P<0.01);SME、SME+GLE和JAS高、低剂量组与模型组相比，IL-6水平均显著降低(均P<0.01);SME、SME+GLE高、低剂量组和JAS高剂量组与模型组相比，TNF-α水平均显著降低(均P<0.01)。

表2各组小鼠血清中谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)含量的比较

表3各组小鼠血清中各细胞因子水平的比较

表4各组小鼠肝组织中抗氧化水平的比较

5 SME及复合制剂对抗氧化作用的影响

模型组与空白组相比，肝中T-SOD、CAT水平均显著降低(均P<0.01);SME、SME+GLE和JAS高、低剂量组与模型组相比，肝中T-SOD、CAT水平均显著升高(均P<0.01),见表4。

三、讨论

水飞蓟、灵芝、丹参作为药食同源中药，已广泛用于缓解乙醇引起的肝损伤。本研究建立了小鼠急性乙醇中毒模型，对SME及其复合制剂的解酒护肝效果及可能的作用机制进行了研究，结果发现，SME、SME+GLE、JAS这3种组方都是具有一定的护肝作用，它们之间的作用差异在于其成分配比、营养素含量等方面的不同。

本研究结果显示，SME、SME+GLE对肝细胞均有一定的修复作用，但是JAS能明显改善肝组织的气球样变；SME能显著下调血清中GPT、GOT含量，能最大程度地降低肝功能的损伤程度；抗氧化结果表明，JAS能显著提高肝的抗氧化水平，缓解由乙醇导致的氧化应激。这证明SME及其复合制剂能有效减轻乙醇对肝的损害，增强肝的代谢和解毒功能，但是有关SME及其复合制剂改善小鼠肝损伤的脂质代谢机制还需要做进一步研究，本研究可为护肝产品的研发提供一个新思路。

参考文献:

[4]张芳艺,林海潞,陈莉莉,等.草菇子实体多肽对小鼠急性乙醇肝的预防作用及肠道菌群的影响[J].食品科学,2023,21(6):1243—3211.

[6]赵文俊,叶倩君,李伟杰,等.自制淡豆豉对SD大鼠急性乙醇性肝损伤的保护作用[J].现代食品科技,2022,38(11):11—19.

[8]王献红,王赟华,张建锋,等.红花黄色素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2020,36(19):3017—3020.

文章来源:王亭乔,任吴疆,吕梁彧,等.水飞蓟提取物及复合制剂对乙醇中毒小鼠肝的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(07):1009-1013.