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苦杏仁苷对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响

2024-04-14 9 上传者：管理员

摘要：目的研究苦杏仁苷对糖尿病肾病(DKD)大鼠肾小管上皮细胞损伤及腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(AMPK/mTOR)通路的影响。方法将SD大鼠分为空白组、模型组、苦杏仁苷低剂量组(3 mg·kg-1)、苦杏仁苷高剂量组(10 mg·kg-1)、Compound C组(2.5 mg·kg-1 AMPK抑制药Compound C)、苦杏仁苷高剂量+Compound C组(10 mg·kg-1苦杏仁苷+2.5 mg·kg-1 Compound C),每组10只。除空白组外，其余各组大鼠用连续喂养高脂高糖饲料+腹腔注射60 mg·kg-1 1%链脲佐菌素(STZ)方法进行DKD造模，造模成功后第2天给予相应药物处理，每天1次，持续给予8周，空白组、模型组均给予等体积0.9%NaCl。用二喹啉甲酸(BCA)法检测大鼠24 h尿蛋白含量，用血糖仪检测大鼠空腹血糖，用全自动生化分析仪检测大鼠血肌酸酐和血尿素氮水平，用原位末端标记法(TUNEL)染色检测大鼠肾组织细胞凋亡情况，用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)水平，用蛋白质印迹(Western Blot)法测定大鼠肾组织AMPK/mTOR通路、自噬及凋亡蛋白的表达水平。结果空白组、模型组、苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷高剂量组、Compound C组和苦杏仁苷高剂量+Compound C组的肾小管损伤评分分别为(0.43±0.05)、(3.26±0.24)、(1.92±0.14)、(0.73±0.06)、(3.81±0.29)和(1.78±0.12)分，细胞凋亡率分别为(5.23±0.41)%、(26.35±2.17)%、(16.76±1.42)%、(6.13±0.53)%、(35.68±3.08)%和(15.92±1.15)%,磷酸化mTOR(p-mTOR)/mTOR分别为0.31±0.03、0.80±0.08、0.60±0.06、0.38±0.04、0.92±0.08和0.69±0.07,磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK分别为0.91±0.08、0.39±0.04、0.56±0.06、0.88±0.07、0.23±0.02和0.52±0.05。模型组的上述指标与空白组、苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷高剂量组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);苦杏仁苷高剂量组的上述指标与苦杏仁苷高剂量+Compound C组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论苦杏仁苷可通过激活AMPK/mTOR信号通路，从而减轻DKD大鼠肾小管上皮细胞损伤。

关键词：
DKD
糖尿病肾病
肾小管上皮细胞
腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物西罗莫司靶蛋白
苦杏仁苷
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糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是由糖尿病导致的肾结构及功能损坏的慢性肾病[1],其发病机制涉及肾小管上皮细胞肥大、肾小管间质纤维化等，而肾小管上皮细胞间充质转化可导致肾小管间质纤维化。终末期DKD会出现肾衰竭，而肾衰竭最典型的临床症状就是肾小管间质纤维化[2]。苦杏仁苷可抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导的支气管上皮细胞间充质转化[3]。激活腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物西罗莫司靶蛋白(adenosine monophosphate activated protein kinase/mammalian target of rapamycin, AMPK/mTOR)信号通路可促进肾细胞自噬，减轻DKD肾损伤，从而延缓其病理进程[4]。本研究基于AMPK/mTOR通路探究苦杏仁苷对DKD大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级雄性SD大鼠，鼠龄6周，体质量200～210 g,购自广州赛业百沐生物科技有限公司。动物生产许可证号：SCXK(粤)2020-0055。本实验经沧州医学高等专科学校动物伦理委员会批准(伦理批号：20230214)。

药品与试剂苦杏仁苷，规格：每支20 mg,批号：A0093,购自成都曼斯特生物科技有限公司；AMPK抑制药Compound C,规格：每瓶10 mg,批号：171260,购自美国Sigma公司。链脲佐菌素，购自美国MCE公司；大鼠白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自上海恒斐生物科技有限公司；兔源一抗B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(B cell lymphoma-2 associated X protein, Bax)、磷酸化AMPK(phosphory-lated AMPK,p-AMPK)、β-actin,均购自上海碧云天生物技术公司；兔源一抗AMPK、mTOR、卞氯素1(Beclin1)、磷酸化mTOR(phosphory-lated mTOR,p-mTOR)、选择性自噬接头蛋白(selective autophagy adaptor protein, p62),均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的羊抗兔二抗，购自英国Abcam公司。

仪器大鼠血糖仪，上海玉研科学仪器有限公司产品；IDEXX Catalyst One®全自动生化分析仪，深圳博兴生物科技有限公司产品；BTM-40显微镜，上海巴拓仪器有限公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建、动物分组与处置方法

高脂饲料喂养4周，禁食12 h后，一次性腹腔注射60 mg·kg-1 1%链脲佐菌素，3 d后通过尾静脉取血进行血糖检测，若血糖水平>16.7 mmol·L-1说明糖尿病模型建造成功。接着连续6周喂养高脂饲料，检测24 h尿蛋白量，若24 h尿蛋白量>20 mg,且尿糖阳性，即为DKD大鼠造模成功[5]。

将SD大鼠随机分为空白组、模型组、苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷高剂量组、Compound C组、苦杏仁苷高剂量+Compound C组、空白组，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠用连续喂养高脂高糖饲料和腹腔注射60 mg·kg-1链脲佐菌素的方法进行DKD造模。空白组喂养普通饲料，腹腔注射等量0.9%NaCl。各组大鼠在造模成功后第2天给予相应药物处理。苦杏仁苷低、高剂量组分别灌胃3、10 mg·kg-1苦杏仁苷[6],腹腔注射等体积0.9%NaCl; Compound C组腹腔注射2.5 mg·kg-1 Compound C[7],灌胃等体积0.9%NaCl;苦杏仁苷高剂量+Compound C组灌胃10 mg·kg-1苦杏仁苷，腹腔注射2.5 mg·kg-1 Compound C;模型组、空白组分别灌胃和腹腔注射等体积0.9%NaCl;持续给药8周，每天1次。

2.2 大鼠24 h尿蛋白含量、血肌酸酐、血尿素氮、空腹血糖指标检测[8]8]

用二喹啉甲酸法检测大鼠24 h尿蛋白含量，用血糖仪检测大鼠空腹血糖，用全自动生化分析仪检测大鼠血肌酸酐水平和血尿素氮水平。

2.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色法检测大鼠肾组织病理变化[9]9]

将固定在4%多聚甲醛中的各组大鼠肾组织，经脱水(室温)、包埋(石蜡)、切片(5μm)、HE染色，每张切片随机取5个视野，于显微镜(×200)下双盲观察，进行肾小管损伤评分。

2.4 TUNEL染色法检测大鼠肾组织细胞凋亡情况[10]10]

取中肾组织切片，严格按照TUNEL染色试剂盒说明书步骤进行染色，并在光镜下观察各组大鼠肾组织细胞凋亡情况，并拍照。染为棕黄色的细胞记为a,总细胞记为b。细胞凋亡率(%)=a/b×100%。

2.5 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平[10]10]

取各组大鼠血液样本离心得血清，用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β水平。

2.6 蛋白质印迹法检测大鼠肾组织中AMPK/mTOR通路、自噬及凋亡蛋白的表达水平[8]8]

将放射免疫沉淀裂解缓冲液与蛋白酶抑制药混合物混合用于提取肾组织匀浆总蛋白，用二喹啉甲酸法测量蛋白质浓度。上样，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜(半干转法，90 min),封闭(脱脂奶粉，1 h),1×TBST洗膜(5 min),将膜在4℃下与一抗p-AMPK、AMPK、Beclin1、p-mTOR、mTOR、Bax、p62、β-actin(均按1∶1 500稀释)孵育过夜。洗涤后与二抗(1∶5 000)在室温孵育1 h。通过ECL试剂和凝胶成像设备检测膜上蛋白质条带。用Image Lab 5.2.1软件分析和定量蛋白图像。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。计量资料经正态分布检验后用表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。

二、结果

1 各组大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白含量、血尿素氮、血肌酸酐水平的比较

空白组喂养普通饲料，腹腔注射等量0.9%NaCl。各组大鼠在造模成功后第2天给予相应药物处理。苦杏仁苷低、高剂量组分别灌胃3、10 mg·kg-1苦杏仁苷，腹腔注射等体积0.9%NaCl; Compound C组腹腔注射2.5 mg·kg-1 Compound C,灌胃等体积0.9%NaCl;苦杏仁苷高剂量+Compound C组灌胃10 mg·kg-1苦杏仁苷，腹腔注射2.5 mg·kg-1 Compound C;模型组、空白组分别灌胃和腹腔注射等体积0.9%NaCl。

模型组与空白组相比，24 h尿蛋白含量、空腹血糖、血肌酸酐、血尿素氮水平均显著增高(均P<0.05);苦杏仁苷低、高剂量组与模型组相比，24 h尿蛋白含量、空腹血糖、血肌酸酐、血尿素氮水平均显著下降(均P<0.05);与苦杏仁苷高剂量组相比，苦杏仁苷高剂量+Compound C组的24 h尿蛋白含量、空腹血糖、血肌酸酐、血尿素氮水平均显著增高(均P<0.05),见表1。

表1各组大鼠空腹血糖、尿蛋白、血尿素氮、血肌酸酐水平的比较

2 各组大鼠肾组织病理变化的比较

空白组、模型组、苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷高剂量组、Compound C组和苦杏仁苷高剂量+Compound C组的肾小管损伤评分分别为(0.43±0.05)、(3.26±0.24)、(1.92±0.14)、(0.73±0.06)、(3.81±0.29)和(1.78±0.12)分。与空白组相比，模型组大鼠肾组织肾小球和肾小管形态不规则，无囊壁结构且伴有大量炎症细胞浸润，肾小管损伤评分明显增高(P<0.05);与模型组相比，苦杏仁苷低、高剂量组大鼠肾组织肾小球和肾小管形态较规则，囊壁结构完整且伴有少量炎症细胞浸润，肾小管损伤评分均显著降低(均P<0.05),Compound C组大鼠肾组织上述病理损伤加重，肾小管损伤评分显著升高(P<0.05);与苦杏仁苷高剂量组相比，苦杏仁苷高剂量+Compound C组大鼠肾组织肾小球和肾小管形态不规则，无囊壁结构且伴有大量炎症细胞浸润，肾小管损伤评分显著升高(P<0.05)。

3 各组大鼠肾组织细胞凋亡的比较

空白组、模型组、苦杏仁苷低剂量组、苦杏仁苷高剂量组、Compound C组和苦杏仁苷高剂量+Compound C组的细胞凋亡率分别为(5.23±0.41)%、(26.35±2.17)%、(16.76±1.42)%、(6.13±0.53)%、(35.68±3.08)%和(15.92±1.15)%。模型组与空白组相比，肾组织细胞凋亡率明显增高(P<0.05);苦杏仁苷低、高剂量组与模型组相比，肾组织细胞凋亡率均明显下降(均P<0.05);Compound C组与模型组相比，肾组织细胞凋亡率明显增高(P<0.05);苦杏仁苷高剂量+Compound C组与苦杏仁苷高剂量组相比，肾组织细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。

4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的比较

模型组与空白组相比，血清TNF-α、IL-1β水平均明显增高(均P<0.05);苦杏仁苷低、高剂量组与模型组相比，血清TNF-α、IL-1β水平均明显下降(均P<0.05);Compound C组与模型组相比，血清TNF-α、IL-1β水平均明显增高(均P<0.05);苦杏仁苷高剂量+Compound C组与苦杏仁苷高剂量组相比，血清TNF-α、IL-1β水平均明显增高(均P<0.05),见表2。

5 各组大鼠肾组织中AMPK/mTOR通路、凋亡及自噬蛋白表达水平的比较

模型组与空白组相比，肾组织p-AMPK/AMPK和Beclin1蛋白相对表达水平均明显下降，p-mTOR/mTOR和Bax、p62蛋白相对表达水平均明显增高(均P<0.05);苦杏仁苷低、高剂量组与模型组相比，肾组织p-AMPK/AMPK和Beclin1蛋白相对表达水平均明显增高，p-mTOR/mTOR和Bax、p62蛋白相对表达水平均明显下降(均P<0.05);与苦杏仁苷高剂量组相比，苦杏仁苷高剂量+Compound C组大鼠肾组织中p-AMPK/AMPK和Beclin1蛋白相对表达水平均显著降低，p-mTOR/mTOR和Bax、p62蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05),见表3。

表2各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平的比较

表3各组大鼠肾组织中AMPK/mTOR通路、自噬及凋亡蛋白表达水平的比较

三、讨论

本研究结果显示，低、高剂量苦杏仁苷干预DKD大鼠模型后，大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白含量、血尿素氮、血肌酸酐、肾小管损伤评分、TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、Bax、p62水平均显著降低，Beclin 1水平均显著升高，大鼠肾组织病理损伤有所改善，提示苦杏仁苷可减轻DKD大鼠肾上皮细胞损伤。

本研究结果显示，低、高剂量苦杏仁苷均显著提高了DKD大鼠肾组织中p-AMPK/AMPK水平，显著降低了p-mTOR/mTOR水平。这表明AMPK/mTOR通路可能参与DKD大鼠肾小管上皮细胞损伤过程。进一步用AMPK/mTOR通路抑制药Compound C干预DKD大鼠，结果显示，24 h尿蛋白含量、空腹血糖、血肌酸酐、血尿素氮、肾小管损伤评分、TNF-α、IL-1β、细胞凋亡率、p-mTOR/mTOR、Bax、p62水平均显著升高，p-AMPK/AMPK、Beclin1均显著降低，大鼠肾组织肾小球和肾小管形态不规则，无囊壁结构且伴有大量炎症细胞浸润，大鼠肺组织病理损伤加重。这提示抑制AMPK/mTOR通路可能加重DKD大鼠肾小管上皮细胞损伤。因此，本研究将高剂量苦杏仁和AMPK/mTOR通路抑制药Compound C联合起来干预DKD大鼠，结果发现，Compound C减弱了高剂量苦杏仁苷改善DKD大鼠肾小管上皮细胞损伤的作用，说明苦杏仁苷可能通过激活AMPK/mTOR通路改善DKD大鼠肾小管上皮细胞损伤。

参考文献:

[4]任梦涵,杨丽霞,梁永林,等.中药单体调控AMPK/mTOR通路介导自噬防治糖尿病肾脏病的研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(18):277—282.

[5]刘霞,王霞,刘霞,等.香芹酚通过SIRT1/FOXO1通路减轻糖尿病肾病大鼠氧化应激损伤[J].重庆医科大学学报,2023,48(7):771—776.

[8]常保超,潘艳,郭亚玲,等.白芍总苷通过增加糖尿病大鼠肾组织自噬活性减轻肾损伤的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(7):984—988.

[9]郭宁,张胜高,杨文忠,等.茯苓四物汤对造影剂诱导的急性肾损伤模型大鼠肾功能及肾小管上皮细胞凋亡的影响[J].广西中医药大学学报,2022,25(2):5—9,24.

[10]张元丽,王素利,张宇,等.金丝桃苷调控胰岛素受体底物1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2023,39(2):241—245.

基金资助:河北省沧州市重点研发指导基金资助项目(192106021);

文章来源:闫萌萌,徐林丽,刘岩岩,等.苦杏仁苷对糖尿病肾病大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(07):1019-1023.