喉癌是发生于喉部的恶性肿瘤，占据全身恶性肿瘤的5%,其中超过95%患者为喉鳞状细胞癌，是头颈部最常见的恶性肿瘤之一[1]。现阶段，全球喉癌的发病率及患病率虽有所降低，但死亡率仍处于升高趋势，说明对其发病机制、诊断及预防还需要进一步完善[2]。环状RNA(circRNAs)是一类不具有5′未端帽子和3′末端poly(A)尾巴、由常规基因经过剪切，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子[3]。现阶段，在喉鳞状细胞癌组织及癌旁组织中circRNAs的表达存在差异，其中包含527个上调的circRNA及414个下调的circRNA,其中位于20号染色体上的circRASSF2命名为circRNA ID[4]。circRNA ID在喉癌中的异常表达与疾病发生发展相关联。miR-543是作为微小RNA(miRNA)家族成员，可促进多种恶性肿瘤的增殖、侵袭。如在人胶质瘤细胞中转染miR-543抑制物可通过下调细胞周期蛋白而抑制细胞增殖，加快凋亡[5]。有研究发现，B细胞白血病同源盒基因(PBX)3可具有调节上皮间充质转化而促进肿瘤的发生发展的作用[6],但是在喉癌中暂无研究。本文探讨circRNA ID在喉鳞状细胞癌中表达及对miR-543/PBX3的影响。

1、材料与方法

1.1主要试剂与仪器

circRNA ID、miR-543及PBX3引物(上海Invitrogen生物技术服务有限公司);Lipofectamine2000[金克隆(北京)生物技术有限公司];DMEM培养基、牛血清及0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);GAPDH抗体、U6抗体(Abcam公司);山羊抗兔IgG(艾维缔科技怀来有限公司);CCK-8试剂盒(日本同仁);流式细胞仪(SV1400流式细胞仪(北京博奥森生物技术有限公司);Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司);细胞培养瓶、细胞培养皿及6孔培养板(Thermo Fisher Scientific-CN);逆转录试剂盒及聚合酶链反应(PCR)试剂盒(上海酶联科研试剂盒);蛋白电泳仪(北京六一)。

1.2 Hep-2培养

人喉癌细胞Hep-2(上海雅吉生物科技有限公司，货号：C7001)。细胞培养：Hep-2置于DMEM培养基，培养环境均为5%CO2、37℃饱和湿度，1∶3传代，取对数细胞进行实验。

1.3 pcDNA3.1(+) circRNA Mini载体的构建

circRNA ID circRNA序列，设计两个反向互补引物，用PCR扩增出circRNA序列。将扩增出的circRNA序列克隆到pEASY-Blunt Zero载体中，并进行测序确认。将circRNA序列切割出来，与pcDNA3.1(+)载体进行连接。连接方式可以选择经典的限制性内切酶消化和连接或者使用无缝克隆技术。将所得到的质粒DNA进行测序，确认circRNA Mini的正确性。扩增出的pcDNA3.1(+) circRNA Mini载体，将其转染到感兴趣的细胞中，进行后续实验。可以通过实时荧光定量(RT-q)PCR方法检测circRNA Mini在细胞中的表达情况。

1.4细胞分组及转染

Hep-2分为对照组(无转染的Hep-2)、空质粒组(Hep-2转染空质粒pcDNA3.1)及circRNA ID组[Hep-2转染质粒pcDNA3.1(+) circRNA Mini]。将Hep-2接种于6孔板中，融合度达到70%时，采用脂质体转染法转染质粒，将质粒pcDNA3.1及质粒pcDNA3.1(+) circRNA Mini各2μg,于培养基中反应20 min,形成脂质体-质粒复合物，转移至培养板，加无血培养基1.5 ml,培养6 h,后换成常规培养基继续培养48 h。

1.5加尾法检测各组喉癌细胞株circRNA ID

在RNase-free PCR管中将以下试剂混合均匀：0.5μg的circRNA样品、2μl的10×RNA逆转录缓冲液、1μl的Oligo(dT)18引物(100 pmol/μl)和0.5μl的RNase抑制剂(40 U/μl)。在65℃水浴中孵育10 min,然后快速冰镇2 min,离心收集材料。加入以下试剂至PCR管中：4μl的5×第一链反应混合液、1μl的dNTP混合物(每个10 mmol/L)、0.5μl的RNA加尾酶和0.5μl的T4 RNA连接酶素2(10 U/μl)。在50℃下逆转录反应60 min,然后在70℃下孵育15 min以终止反应。加入以下试剂至PCR管中：2μl的10×PCR缓冲液、1μl的dNTP混合物(每个10 mmol/L)、0.5μl的Taq DNA聚合酶(5 U/μl)和0.5μl的环状RNA特异性引物(10 pmol/μl)。circRNA特异性引物是设计在环状RNA的连接处，可以扩增整个环状RNA分子。进行PCR扩增。温度程序为95℃5 min,然后35个循环：95℃30 s, 58℃45 s, 72℃2 min,最后72℃延长10 min。 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，检查是否扩增到预期大小的目标带。

1.6 RT-qPCR检测miR-543及PBX3mRNA相对表达

各组Hep-2移入离心管中，加入100μl的总RNA抽提试剂Trizol,进行摇晃，加入40μl的氯仿，持续震动10 s。静置10 min,离心15 min,明显分离层，将上层RNA进行吸取，离心管中冷却后再次加入氯仿，摇匀后孵育10 min, 4 000 r/min离心15 min后，保留下方沉淀物，加入2 ml的乙醇，对沉淀物进行洗涤。离心机转数8 000 r/min离心，沉淀干燥，加入15μl的超纯水，待RNA完全水解后，75℃保温20 min,采用分光光度计检测RNA的紫外吸收值比值。反应条件：95℃,5 s, 60℃,30 s, 40个循环，将提取的RNA进行转录为cDNA,获得反体系10μl,检测结果采用2-ΔΔCt方法进行分析，引物序列为：miR-543:正向5′-GCTCAAACATTCGCGGTGC-3′,反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;PBX3正向5′-CAACTTCAGGTTTGCCAA-3′,反向5′-TGA-ACAGTGAGGGCCTAGAT-3′;GAPDH正向5′-CAG-CCTCAAGATCATCAGCA-3′,反向5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.7 CCK-8法检测细胞活性

将Hep-2细胞浓度调整为5×103/ml,接种于6孔板中培养，贴壁培养24 h后，加入CCK-8试剂(5 g/L),每孔20μl,在计入200μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，充分溶解15 min,继续培养24、48、72、96 h时取出培养板，在酶标仪450 nm波张处检测吸光度(OD)值，实验3次，复孔2次。

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡率

Hep-2采用0.125%蛋白酶消化，接种到无胎牛血清中培养，24 h后收集细胞，采用PBS冲洗，取100μl品管细胞，放入离心机中3 500 r/min离心5～10 min,收集悬液细胞，重新加入300μl的1×结合缓冲液于样品管悬浮细胞，同时加入膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)5μl混匀，染色AnnexinⅤ-FITC并标记，最后加入5μl碘化丙啶(PI)于样本中，5 min后采用流式细胞仪检测。

1.9 Transwell小室检测细胞侵袭能力

将50 mg/L的基质胶稀释后加入小室上层，37℃下呈凝胶状态，下室中加入500μl的躯化剂，上室加入100μl无血清培养基(其中Hep-2数量为2×105个),24 h后，去除多余残留细胞，甲醛溶液固定，冲洗、风干，0.1%结晶紫染色45 min,计算侵袭细胞数。

1.10细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率

1×106/L的Hep-2接种6孔板中，待贴壁生长整个底部时，采用200μl移液枪头，垂直划一条划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，分别在划痕后0 h及24 h后在倒置显微镜下进行拍摄。划痕愈合率=[(0 h宽度-24 h宽度) / 0 h宽度]×100%,实验3次，复孔2次。

1.11 Western印迹检测各组细胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达

取2.5×104个/ml的Hep-2放入1.5 ml离心管中，4℃1 000 r/min离心3 min,弃去上清也，加入150μl放射免疫沉淀(RIPA)的裂解液；在冰上对细胞进行超声裂解后，4℃12 000 r/min离心5 min,取上清液检测浓度。上样表述为每孔上样50～100μg进行聚偏氟乙烯(PVDF)电泳分离，切胶后转膜，加入脱脂牛奶室温封闭1 h,加入E-钙黏蛋白(cadherin, 1∶150)、N-cadherin(1∶200)、Vimentin(1∶200)和内参GAPDH抗体(1∶1 000),TBS冲洗3此后，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔(1∶5 000),杂交冲洗。后将膜浸入ECL工作液，随后进行检测，获取图像。

1.12 RNA Pull-down实验

取100 g腺病毒介导过表达circRNA ID的细胞总RNA,再将500 g的链霉亲+素磁珠与miR-543 mimic(200 pmol生物素标记)结合后，加入RNA,孵育30 min,加入PBS,收集其复合物，采用RT-qPCR对circRNA ID表达进行定量分析。

1.13裸鼠实验

取10只4周龄、体质量11～13 g的健康BALB/c雄性裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司),按照随机数字方法分为空白组及实验组，每组5只，对照组右前肢腋下接种对数生长的喉癌细胞悬液，circRNA ID组右前肢腋下接种对数生长的喉癌细胞(已转染质粒pcDNA3.1-circRNA ID),细胞含量2×107个/ml,每只接种量为0.1 ml。21 d后颈椎脱臼处死动物后剥取肿瘤组织并称重，抑瘤率(%)=(模型组瘤重-干预组瘤重)/模型组瘤重×100%。

1.14统计学分析

采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2、结 果

2.1各组Hep-2中circRNA ID相对表达量比较

对照组和空质粒组Hep-2中circRNA ID相对表达(1.00±0.00 vs 1.03±0.05)无明显差异(P>0.05);与空质粒组相比，circRNA ID组Hep-2中circRNA ID相对表达(1.36±0.09)明显升高(P<0.05)。

2.2各组Hep-2细胞活性比较

对照组、空质粒组及circRNA ID组Hep-2细胞活性均随时间(24、48、72、96 h)的延长而明显升高，且呈明显时间依赖性(P<0.05)。进一步两两比较，对照组和空质粒组在24、48、72、96 h时Hep-2细胞活性无明显差异(P>0.05);与空质粒组相比，circRNA ID组24、48、72、96 h时Hep-2细胞活性均明显升高(P<0.05),见表1。

表1各组Hep-2细胞增殖活性

2.3各组Hep-2细胞凋亡率比较

3组Hep-2细胞凋亡率差异有统计学意义(F=161.700,P<0.001)。与对照组[(10.60±0.85)%]相比，空质粒组Hep-2细胞凋亡率[(10.35±0.93)%]无明显差异(t=0.486,P=0.637);与空质粒组相比，circRNA ID组Hep-2细胞凋亡率[(3.07±0.67)%]明显降低(t=15.560,P<0.001),见图1。

图1各组Hep-2细胞凋亡 

2.4各组Hep-2细胞侵袭数比较

3组细胞侵袭数差异有统计学意义(F=31.850,P<0.001)。与对照组[(65.72±7.52)个]相比，空质粒组Hep-2细胞细胞侵袭数[(66.10±8.07)个]无明显差异(t=0.296,P=0.773);与空质粒组相比，circRNA ID组Hep-2细胞侵袭数[(103.60±12.08)个]明显增多(t=4.023,P=0.002),见图2。

图2各组Hep-2细胞侵袭数目(结晶紫染色，×200)  

2.5各组Hep-2细胞划痕实验

3组划痕愈合率差异有统计学意义(F=12.130,P<0.05)。与对照组[(72.30±7.20)%]相比，空质粒组Hep-2细胞划痕愈合率[(73.55±7.41)%]无明显差异(t=0.084,P=0.934);与空质粒组相比，circRNA ID组Hep-2细胞划痕率[(91.52±8.05)%]明显增加(t=6.323,P=0.001),见图3。

2.6各组Hep-2中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达比较

与对照组相比，空质粒组Hep-2中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白无明显差异(P>0.05);与空质粒组相比，circRNA ID组Hep-2中E-cadherin蛋白明显降低，N-cadherin及Vimentin蛋白显著升高(P<0.05),见表2、图4。

2.7各组Hep-2中miR-543及PBX3mRNA相对表达量比较

与对照组相比，空质粒组Hep-2中miR-543及PBX3 mRNA无明显差异(P>0.05);与空质粒组相比，circRNA ID组Hep-2中miR-543及PBX3 mRNA相对表达明显升高(P<0.05),见表2。

图3各组Hep-2细胞划痕实验(×200)   

表2各组Hep-2细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达和miR-543、PBX3 mRNA比较

图4各组Hep-2细胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表达  

2.8 circRNA ID与miR-543及PBX3的相关性

Hep-2中circRNA ID与miR-543、PBX3呈明显正相关(r=0.592、0.496,均P<0.001),见图5。

图5 circRNA ID与miR-543、PBX3相关性  

2.9 RNA Pull-down实验结果

实验通过设计生物素标记的miR-543mimic,用磁珠富集拉下的RNA,RT-qPCR结果表明，miR-543-NC组及miR-543mimics组的circRNA ID的表达分别为1.00±0.00、1.68±0.12,差异有统计学意义(t=13.880,P<0.001),说明miR-543mimic能特异结合circRNA ID(P<0.05)。

2.10 circRNA ID对裸鼠喉癌瘤体质量、抑瘤率及HE染色

空白组及实验组裸鼠喉癌瘤体质量分别为(1.65±0.22)、(2.30±0.26)g,抑制率分别为(0.00±0.00)%、(39.39±0.18)%,差异有统计学意义(P<0.05),见图6。HE染色结果显示，空白组裸鼠未见淋巴结转移，实验组可见淋巴结转移，见图7。

图6两组肿瘤体质量比较

图7两组裸鼠肿瘤组织(HE染色，×200)  

3、讨 论

喉鳞状细胞癌是常见的源于喉部黏膜上皮组织的疾病，手术是临床治疗首选方法，但部分患者的预后仍然不理想。有研究表明，癌细胞的大量侵袭及转移是喉鳞状细胞癌患者预后较差的主要原因，因此抑制细胞生物活性对于临床治疗及预后具有重要意义[7]。

circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，研究发现，circRNA可以调节癌症的多种生物学功能，如增殖、转移和血管生成等，具有重要的肿瘤相关临床意义[8]。circRNA ID在多种恶性肿瘤中表达异常，如在甲状腺乳头状癌组织及细胞中均发现其表达上调，并认为下调circRNA ID抑制甲状腺乳头状癌(PTC)细胞增殖，促进细胞凋亡。进一步通过双荧光素酶实验证实，circRNA ID通过miR-1178/Toll样受体(TLR)4途径调节细胞活性而促进疾病进展[9]。喉鳞状细胞癌组织及正常黏膜组织中发现多种差异表达的circRNA,circRNA ID是其中之一。国外学者采用甲基化特异性PCR技术检测喉鳞状细胞癌及正常喉组织的circRNA ID mRNA及甲基化水平，认为circRNA ID的甲基化水平在喉鳞状细胞癌组织中显著高于正常喉组织，认为其可能在喉鳞状细胞癌疾病的发生发展过程中发挥重要作用[10]。也有研究表明，沉默circRASSF2通过与miR-302b-3p相互作用和减少抑制IGF-1R表达来抑制LSCC的进展。机制认为circRASSF2是通过miR-302b-3p/胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)轴将circRNAs与肺鳞癌(LSCC)进展联系起来的中心成分[11]。本文与之研究结果相似。本研究结果说明，上调circRNA ID可加快喉鳞状细胞癌进展。

E-cadherin、N-cadherin是钙黏附分子家族与肿瘤转移密切相关的成员，可对癌细胞发挥识别及参与组织形态的改变。波形蛋白(Vimentin)是一种在刺激的中间细丝(IFs)中发现的蛋白质，可促进肿瘤细胞迁移和侵袭，是上皮-间质转化的关键因素(EMT)是转移过程的关键早期阶段[12]。在喉癌组织中，N-cadherin及Vimentin表达升高，而E-cadherin表达降低，并可促进肿瘤细胞侵袭及迁移[13]。本研究结果说明，上调circRNA ID对EMT相关因子进行调控进而发挥抗肿瘤作用。有研究表明，circRNA ID和Vimentin确实相互作用，共转染用红色荧光蛋白-circRNA ID和绿色荧光蛋白-Vimentin对非洲绿猴肾(COS-7)细胞进行荧光显微镜分析证实，Vimentin与circRNA ID在细胞核中共定位，circRNA ID与Vimentin之间的相互作用，是加快细胞侵袭及转移的关键因素[14]。目前，就circRNA ID对E-cadherin、N-cadherin的研究减少。但有学者关于RASSF1对肿瘤细胞侵袭的研究发现，RASSF1C可促进肿瘤侵袭性的作用，并进一步RASSF1C实际上通过促进原癌基因酪氨酸蛋白激酶(SRC)/yes抑制E-cadherin水平来支持肿瘤的发生[15]。

miR-543是一个与肿瘤相关的miRNA,在肿瘤的发生发展中具有关键作用。如结直肠癌患者的临床组织miR-543表达显著低于癌旁组织，并通过体外细胞实验证实，过表达miR-543可明显抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移[16]。但是在不同肿瘤组织中表达也有所差异，在宫颈癌组织中miR-543表达显著高于正常宫组织，通过沉默其表达后可显著缩短迁移距离，抑制侵袭及转移[17]。PBX3在多种人类癌症类型的侵袭、转移和增殖中起着重要作用[18,19]。在胃癌组织中逆转录PCR显示，PBX3在胃癌组织中上调，同时过表达PBX3促进胃癌的侵袭和转移，机制在于过表达PBX3可诱导胃癌细胞EMT,N-cadherin和Vimentin升高，E-cadherin表达降低，进而促进疾病恶化[20]。但是在miR-543及PBX3喉癌中暂无研究。本文通过体外细胞实验中表明，miR-543、PBX3在circRNA ID作用下表达升高而加快癌细胞增殖、侵袭及迁移，减少凋亡，还发现circRNA ID与miR-543、PBX3呈现正相关性，miR-543mimic能特异结合circRNA ID,并认为circRNA ID可促进miR-543/PBX3表达而加快喉鳞状细胞癌疾病发生发展。

综上，circRNA ID促进喉癌细胞活性，降低凋亡，并通过调控细胞间质转化相关蛋白加快癌细胞侵袭及迁移，与miR-543/PBX3存在正相关性。本文尚存在一定不足，未比较喉癌组织及癌旁组织中circRNA ID表达，今后应更全面地了解喉癌组织中这些circRNA ID的特征及在喉癌发生发展过程中的潜在作用。

参考文献:

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