肺癌在全球恶性肿瘤中的致死率居首位，且在2022年中国恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率均为第一[1-2]。小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)占肺癌的15%,其预后差，SCLC局限期患者的中位总生存期(overall survival, OS)为17个月，广泛期患者仅为10～12个月[3-4]。拓扑异构酶抑制剂联合铂类化合物的双药化疗方案是SCLC患者的一线化疗方案，如依托泊苷(etoposide, VP-16)联合顺铂(cisplatin, DDP)的化疗方案(EP联合方案)[1];但几乎所有SCLC广泛期患者在完成治疗后几个月内都会复发并产生化疗耐药[5-6],SCLC患者对其耐药的机制尚未阐明。

临床肿瘤化疗方案以多药联合化疗为主，SCLC一线化疗方案即为多药联合化疗。而当前肿瘤化疗耐药机制的报道多为肿瘤对单个药物耐药的机制研究[7-8],并不足以反映临床化疗耐药的实际情况，因此基于SCLC EP联合方案多药耐药机制的研究十分必要。

肿瘤耐药细胞株的构建是诱导肿瘤细胞对特定药物产生耐药性的过程，肿瘤细胞产生耐药性后，化疗药物对其药效大幅度下降。体外构建肿瘤耐药细胞株，模拟临床肿瘤化疗过程中的获得性耐药是研究化疗多药耐药机制的前提，可以为攻克临床肿瘤化疗耐药奠定基础[9]。药物浓度递增法是常用的肿瘤耐药细胞株构建方法[10],该方法中使用化疗药物的剂量循序增大，细胞培养环境逐渐改变，使得肿瘤细胞可以对化疗药物逐步产生耐受，模拟临床化疗过程中肿瘤逐步对化疗药物产生耐药性的过程，构建成的耐药细胞状态较好，但该方法的缺点是诱导过程耗时长。

本研究根据SCLC一线EP联合方案，联合使用VP-16与DDP,以药物浓度递增法历时13个月构建成EP联合方案耐药的SCLC细胞株H446/EP,并通过转录组学测序寻找可能与SCLC耐药有关的基因，初步探讨其耐药机制。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 细胞

NCI-H446细胞购自ACTT细胞库。

1.1.2 主要试剂

顺铂(cisplatin, DDP),规格：100 mg, CAS号：15663-27-1,批号：115583;依托泊苷(etoposide, VP-16),规格：200 mg, CAS号：33419-42-0,批号：113741;多柔比星(doxorubicin, DOX),规格：50 mg, CAS号：25316-40-9,批号：156516,以上药物均购自美国MedChemExpress公司；RPMI Medium 1640 basic培养基购自Gibco公司；FBS血清购自武汉Procell公司；MTT购自碧云天生物技术有限公司；PBS、TBS均购自Biosharp公司；封闭专用脱脂奶粉购自北京普利莱基因技术有限公司；快速凝胶制备试剂盒购自上海雅酶生物医药公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；β-actin(鼠抗，货号：4790)、MRP1/ABCC1(MRP1,兔抗，货号：72202)、ABCG2(BCRP,兔抗，货号：42078)、RAD51(兔抗，货号：8875)、SQSTM1/p62(p62,兔抗，货号：5114)、LC3A/B(LC3,兔抗，货号：12741)单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology; Anti-gama H2A.X抗体(γ-H2AX,兔抗，货号：ab81299)购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(货号：ZB-2301)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(货号：ZB-2305)均购自中国中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

NCI-H446及H446/EP细胞常规培养于含10% FBS的RPMI Medium 1640 basic完全培养基中，在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中进行培养。

1.2.2 药物浓度递增法构建H446/EP细胞株

采用浓度递增的VP-16、DDP构建耐药细胞株(两药浓度梯度依次均为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol/L):在培养瓶中稳定培养NCI-H446细胞，当传至第3代，待细胞密度达到80%,使用终浓度0.2 μmol/L的VP-16联合DDP处理细胞24 h, 后按1∶2比例正常传代，使用不含药完全培养基进行培养。待细胞再次生长至80%,使用下一个更高梯度浓度VP-16联合DDP处理细胞24 h, 重复上述操作。每次正常传代后待细胞密度至80%,使用下一个更高梯度浓度VP-16联合DDP处理细胞24 h, 再进行常规培养。构建周期为13个月。

1.2.3 MTT法检测细胞活力并计算耐药指数

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为每毫升2×104个细胞，按每孔180 μL将单细胞悬液接种于96孔培养板中，过夜待细胞贴壁后，分别加入不同终浓度VP-16(0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L)、DDP(0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)及DOX(0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)处理细胞，每组设置3个复孔。48 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL,继续培养4 h, 吸出上清，每孔加入DMSO 150 μL,震荡10 min摇匀，使用酶标仪在波长570 nm下检测每孔光密度值。

细胞活力=(实验组光密度值-空白组光密度值)/(对照组光密度值-空白组光密度值)。

耐药指数(resistance index, RI)=H446/EP细胞药物IC50值/NCI-H446细胞药物IC50值。

耐药标准：2≤RI<5,细胞呈轻度耐药；5≤RI<15,细胞呈中度耐药；RI≥15,细胞呈高度耐药。

1.2.4 细胞克隆检测细胞增殖

取对数生长期的细胞，按每孔1×103个将细胞接种于12孔细胞培养板中，细胞过夜贴壁后，加入终浓度为0.125、0.250、0.500 μmol/L的VP-16联合DDP处理细胞14 d, 每2 d更换含有相应浓度药物的新鲜完全培养基。14 d后，弃上清，每孔用1 mL PBS清洗细胞2～3次后，加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞1 h后弃去多聚甲醛，PBS清洗2～3次，每孔加入1 mL结晶紫溶液染色1 h, 弃去结晶紫溶液，使用纯水清洗12孔板2～3次，置于干燥处自然晾干后拍照。

1.2.5 Incucyte细胞增殖(无标记)法检测细胞增殖

调整细胞密度为每毫升2.5×104个细胞，按每孔180 μL将NCI-H446、H446/EP单细胞悬液接种于96孔培养板中，分别设置不加药组与加药组，每组设置3个复孔。过夜待细胞贴壁后，加药组使用终浓度0.5 μmol/L的VP-16联合DDP处理细胞，将细胞培养板放入Incucyte S3活细胞分析仪，设定程序，检测各组细胞120 h内增殖情况；同时设定Incucyte活细胞分析系统拍摄各组细胞不同时间点生长情况图片。

1.2.6 转录组学测序

收集对数生长期的H446/EP与NCI-H446细胞用于转录组学测序。使用TRIzol试剂盒，按照制造商说明从细胞中提取总RNA。RNA质量由5300生物分析仪(Agilent)测定，并使用ND-2000(NanoDrop Technologies)进行定量；RNA纯化、逆转录、文库构建和测序在上海华盈生物医药科技有限公司完成。

1.2.7 KEGG功能富集分析

转录组学测序结果以|log2FoldChang|>1,P-value值<0.05为具有显著差异的标准找到差异表达基因，对差异基因应用clusterProfiler超几何分布算法分析，进行KEGG通路富集分析，查看差异基因集显著富集通路。

1.2.8 Western blot检测蛋白表达

待细胞生长至对数生长期时，收集各组细胞；用预冷的PBS漂洗2次后弃干净上清，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，后依次进行SDS-PAGE电泳分离、转膜、室温2 h 5%脱脂奶粉封闭、4 ℃ 过夜一抗孵育、室温2 h二抗孵育及ELC化学发光显影操作，最后使用Image J软件分析MRP1、BCRP、RAD51、γ-H2AX、p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达量(IntDen)。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0与IBM SPSS Statistics 27.0软件进行绘图及数据分析，计量资料用

表示，两组比较用t检验。

2、结果

2.1 EP联合方案耐药的SCLC细胞株H446/EP构建成功

分别使用不同浓度VP-16、DDP或DOX处理NCI-H446以及连续30 d不接触药物的H446/EP细胞48 h, MTT实验结果显示药物处理后H446/EP细胞的活力显著高于NCI-H446细胞(P<0.05,P<0.01),见图1A～C。对于NCI-H446与H446/EP细胞，VP-16的IC50值分别为6.77 μmol/L与41.56 μmol/L,DDP的IC50分别为2.18 μmol/L与7.47 μmol/L,DOX的IC50值分别为5.94 μmol/L与11.64 μmol/L。计算得H446/EP细胞对VP-16、DDP与DOX的RI分别为6.14、3.43与1.96,表明H446/EP细胞对VP-16呈中度耐药，对DDP呈轻度耐药，且在未接触过蒽环类药物DOX情况下对其敏感性也降低。提示EP联合方案耐药的SCLC细胞株构建成功，具有多药耐药性。

2.2 H446/EP细胞增殖能力相比NCI-H446细胞显著增强

分别采用各0.125、0.250、0.500 μmol/L的VP-16联合DDP处理NCI-H446与H446/EP株细胞14 d, 细胞克隆实验检测药物对NCI-H446与H446/EP细胞增殖能力的影响，结果显示VP-16联合DDP作用下H446/EP比NCI-H446细胞增殖能力更强，具有多药耐药性，见图2A。

活细胞分析系统检测结果显示，H446/EP细胞增殖能力显著升高(P<0.01),见图2B。使用VP-16、DDP各0.5 μmol/L处理NCI-H446及H446/EP细胞120 h, 检测结果显示药物作用下H446/EP细胞增殖能力显著强于NCI-H446细胞(P<0.01),见图2C。未加药或加药组细胞120 h后生长情况图片显示：相比于未加药组，药物处理组所有NCI-H446细胞全部不再具有细胞形态，细胞核体积膨大，完全失去增殖能力；药物处理组H446/EP细胞部分体积膨大，仍有细胞具有细胞形态及增殖能力，见图2D。表明VP-16联合DDP作用下H446/EP细胞增殖能力更强，具有多药耐药性。

2.3 H446/EP细胞转录组发生改变

将H446/EP及NCI-H446细胞进行转录组学测序，结果显示两种细胞共有2 849个差异表达基因。与NCI-H446细胞相比，H446/EP细胞有1 319个基因显著上调，有1 530个基因显著下调，其中可能存在与SCLC对EP联合方案耐药相关基因，见图3A。

KEGG富集分析显示，差异表达基因富集在了肿瘤耐药、细胞自噬、DNA损伤修复(DNA damage repair, DDR)相关通路，如铂类化合物耐药、自噬、范可尼贫血等通路，见图3B。提示DDR、细胞自噬等通路可能参与了SCLC的EP联合方案耐药。

2.4 H446/EP细胞中耐药标志蛋白的表达

Western blot结果显示，H446/EP细胞中耐药标志蛋白MRP1、BCRP蛋白表达量相比NCI-H446细胞显著升高(P<0.01),见图4A、B,进一步表明EP联合方案耐药SCLC细胞株H446/EP构建成功。Western blot结果提示SCLC耐EP联合方案的机制可能与药物外排转运增加有关。

图1 不同浓度VP-16(A)、DDP(B)、DOX(C)对NCI-H446与H446/EP细胞活力的影响

a:P<0.05,b:P<0.01,与NCI-H446组比较

图2 NCI-H446与H446/EP细胞增殖情况

2.5 H446/EP细胞中DDR相关蛋白的表达

KEGG富集分析显示差异表达基因在DDR相关通路富集，见图3 B。Western blot结果显示H446/EP细胞中DDR标志分子RAD51与γ-H2AX蛋白表达量相比NCI-H446细胞显著升高(P<0.01),见图5。表明H446/EP细胞中DDR水平显著升高，提示SCLC耐EP联合方案的机制可能与DDR相关分子、通路的改变有关。

2.6 H446/EP细胞中自噬相关蛋白的表达

KEGG富集分析显示H446/EP细胞中自噬相关通路激活，见图3B。Western blot结果显示，与NCI-H446细胞相比，H446/EP细胞的自噬标志分子p62蛋白表达量显著降低，LC3-II/LC3-I蛋白表达量显著升高(P<0.01),见图6 A、B,表明H446/EP细胞中基础自噬水平升高，提示SCLC耐EP联合方案的机制可能与细胞自噬水平增加相关。

图3 NCI-H446、H446/EP细胞转录组学测序结果

图4 细胞中耐药标志蛋白的表达

图5 细胞中DDR相关蛋白的表达

3、讨论

SCLC对EP联合方案耐药性的产生大大降低了患者的临床获益[1, 6],而临床SCLC患者多药耐药机制尚未阐明。本研究通过构建EP联合方案耐药的SCLC细胞株来探讨SCLC的化疗多药耐药机制。目前肿瘤耐药细胞株的构建方法主要有：基因转染法[11]、大剂量药物冲击法[12]、药物浓度递增法[10]等。基因转染法构建肿瘤耐药细胞株虽耗时短，但构建的细胞株所反映的耐药机制单一，不能很好模拟临床肿瘤化疗耐药产生的过程；大剂量药物冲击法在肿瘤耐药细胞株构建过程中使用的化疗药物浓度高，肿瘤细胞可能由于培养环境骤变而难以耐受，生长状态难以控制，耐药性不稳定。药物浓度递增法构建的耐药细胞株状态较好，可以模拟临床化疗过程中肿瘤逐步对化疗药物产生耐药性的过程，因此本研究同时使用VP-16与DDP处理NCI-H446细胞，以药物浓度递增法构建EP联合方案耐药的SCLC细胞株H446/EP,通过MTT实验确证了细胞对VP-16呈中度耐药、对DDP呈轻度耐药，还确证了H446/EP细胞对未接触过的蒽环类药物DOX的敏感性也降低，表明H446/EP细胞产生了多药耐药性。

图6 细胞中自噬相关蛋白的表达

细胞克隆实验及Incucyte活细胞分析系统检测结果显示药物作用下H446/EP细胞增殖能力增强；VP-16联合DDP连续作用120 h后，NCI-H446细胞不再具有细胞形态，完全失去增殖能力，而H446/EP细胞仍具有细胞形态，有增殖能力。以上结果表明H446/EP细胞对EP联合方案产生了耐药性，120 h细胞生长状态图片证实了上述结论。图片还显示药物连续作用120 h后H446/EP细胞生长变慢，形态同样略有膨大、变为长梭形，表明VP-16与DDP对耐药细胞仍具有一定杀伤作用。

转录组是指在特定环境或生理条件下的一个细胞或一个细胞群中RNA分子的集合，对H446/EP以及其亲本NCI-H446细胞进行转录组学测序可以找到2种细胞差异表达基因，其中可能存在与SCLC对EP联合方案耐药相关的基因。KEGG富集分析结果显示，差异表达基因在肿瘤耐药相关通路富集，如铂类化合物耐药等，表明H446/EP细胞中获得性耐药基因发生了改变。KEGG富集分析还显示差异表达基因富集在了DDR与细胞自噬相关通路，如范可尼贫血、自噬通路等。已有研究报道肿瘤耐药与DDR和自噬相关[13-14],表明SCLC对EP联合方案的耐药可能与DDR和细胞自噬通路的激活有关。因此，本研究检测了H446/EP和NCI-H446细胞中耐药、DDR与细胞自噬标志分子的蛋白表达量。具体参与SCLC EP联合方案耐药的分子机制将在后续进行深入研究。

耐药标志蛋白的检测是肿瘤耐药细胞耐药特性鉴定方法之一。MRP1[15]、BCRP[16]是肿瘤耐药标志蛋白，它们属于ABC转运蛋白家族，可以促进肿瘤细胞中化疗药物的外排，而化疗药物外排的增加正是肿瘤耐药的关键因素[17-18];MRP1还是SCLC的不良预后标志物[19]。目前已有许多研究发现通过调控ABC转运蛋白可以改善肿瘤耐药[20-21]。本研究发现，在耐EP联合方案的SCLC细胞H446/EP中MRP1、BCRP蛋白表达量升高，进一步表明耐药细胞株构建成功；SCLC细胞对EP联合方案的耐药机制可能是细胞ABC转运蛋白水平升高，被细胞外排的药物增加，从而导致胞内化疗药物减少，药物疗效降低。

细胞内的DNA会因为内源或外源性攻击而受损，研究人员发现细胞可以通过复杂的信号传导系统来抵抗DNA损伤，这个过程被称为“DNA损伤修复(DDR)”[22]。化疗或放疗时，抗肿瘤药物，如VP-16、DDP,会对肿瘤细胞的DNA产生强烈的损伤，从而引起DDR,DDR水平增加可通过多种机制引起癌症化疗、放疗的耐药[14, 23]。γ-H2AX是DDR通路的典型标志物，它对DNA双键断裂(DNA double-strand break, DDSB)后的DNA修复是必不可少的[24]:DDSB发生后，会激活共济失调毛细血管扩张突变(ataxia-telangieclasia-mutated, ATM)激酶，ATM激酶可以快速磷酸化H2AX,从而产生γ-H2AX,并激活下游p53来介导不同形式的DDR[25-26]。RAD51在DDR中也发挥了重要作用：DNA损伤后，BRCA1被募集到DDSB中，促进DDSB末端切除，并募集PALB2及RAD51,从而启动DDR中的同源重组(homologous recombination, HR)修复[27];肿瘤中的RAD51过度表达会引起HR水平增加，降低肿瘤化疗敏感性[28-29]。在本研究中，H446/EP细胞与NCI-H446细胞转录组差异表达基因富集在DDR相关通路，同时H446/EP细胞中γ-H2AX、RAD51蛋白表达量升高，提示耐EP联合方案的SCLC细胞内DDR相关蛋白水平增加、DDR通路激活，其耐药机制可能与DDR水平升高有关。

细胞自噬是一种对受损细胞器或错误折叠蛋白进行降解和循环利用的保守代谢过程，肿瘤发展的中、晚期，普遍的自噬水平增加促进了肿瘤细胞的存活并增加了肿瘤的恶性程度[30-31]。在自噬过程中，LC3被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，生成胞浆型LC3-Ⅰ,通过Atg7和Atg3参与的类泛素样反应，使磷脂酰乙醇胺偶联，胞浆型LC3-Ⅰ生成LC3-Ⅱ,它附着到自噬体的膜上，即自噬体膜型LC3-Ⅱ;自噬体与溶酶体结合后，溶酶体降解自噬体会导致p62水平的降低，因此LC3、p62是自噬标志蛋白，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的转化以及p62的表达量是判断自噬流的重要标志[32-33]。有研究显示，肿瘤细胞自噬水平的增加与化疗耐药相关，可导致肿瘤的多药耐药[13];抗肿瘤药物联合自噬抑制剂，可以增加药物抗肿瘤疗效[34-35]。在本研究中，H446/EP细胞与NCI-H446细胞转录组差异表达基因富集在了自噬相关通路；H446/EP细胞中p62蛋白表达量显著下调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量明显升高，表明H446/EP细胞的基础自噬水平比亲本化疗敏感的NCI-H446细胞高，提示SCLC对EP联合方案产生耐药性可能是肿瘤细胞基础自噬水平升高所致。

综上，本研究成功构建了耐EP联合方案的SCLC细胞株H446/EP,并发现其耐药机制可能与药物外排增加、DDR及细胞自噬水平上调有关。本研究为临床逆转SCLC化疗耐药策略研究奠定了基础。

参考文献:

[1]中华医学会肿瘤学分会,中华医学会杂志社.中华医学会肺癌临床诊疗指南(2023版)[J].中华医学杂志,2023,103(27):2037-2074.

[10]俞毅麟,肖艺,赵娟娟,等.三阴性乳腺癌耐药细胞模型的构建及其生物学特性考察[J].中国药学杂志,2022,57(22):1901-1910.

[11]荣小丽.LIMK1基因稳定转染骨肉瘤耐药细胞系的建立及其增殖侵袭能力的研究[D].长春:吉林大学,2016.

[12]延冰,刘国勤,姜永胜,等.高剂量法诱导胃癌铂类耐药细胞株的建立及其生物学特性[J].山东大学学报(医学版),2014,52(4):49-52,57.

基金资助:国家自然科学基金(82373901);重庆市自然科学基金创新发展联合基金(2022NSCQ-LZX0068);重庆市高校创新研究群体项目(CXQT20012)~~;

文章来源:刘明菩,王红梅,伍元丽,等.EP联合方案耐药小细胞肺癌细胞株的构建及机制探讨[J].陆军军医大学学报,2024,46(18):2092-2100.