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右美托咪定联合顺铂对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响

2020-09-23 164 上传者：管理员

摘要：为研究右美托咪定联合顺铂对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响,将72只C57BL/6J小鼠随机分为6组(每组12只)如下:对照组(N组)、假手术组(S组)、模型组(M组)、Dex组(D组)、顺铂组(C组)及Dex联合顺铂组(DC组)。称量小鼠瘤体积、瘤质量、体质量及脾脏、胸腺质量;MTT法检测肿瘤细胞增殖活性;FCM检测肿瘤细胞凋亡率;ELISA检测小鼠血清TNF-α、IL-6表达水平;Westernblotting检测肿瘤组织中IL-6、信号转导与转录激活因子3、p-STAT3蛋白表达量。结果显示,DC组小鼠瘤质量、瘤体积、瘤组织IL-6水平、p-STAT3/STAT3蛋白表达量均显著低于D、C组(P<0.05),肿瘤细胞凋亡率、脾脏、胸腺指数、白细胞、骨髓细胞、淋巴细胞计数、淋巴细胞增殖活性、血清TNF-α水平均显著高于D、C组(P<0.05)。由此,Dex联合顺铂可促进Lewis肺癌小鼠免疫功能,减轻化疗对小鼠的免疫抑制,可能与抑制IL-6/STAT3信号通路激活有关。

关键词：
Lewis肺癌小鼠
信号转导与转录激活因子3通路
免疫功能
右美托咪定
肺癌
骨髓细胞
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目前化疗依然是治疗肺癌的主要手段,然而其严重影响患者的免疫功能,引起免疫抑制并发症[1]。右美托咪定是一种新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有抗氧化、抑炎作用并影响细胞免疫功能[2,3]。IL-6是重要的炎性因子,其信号通路异常与卵巢恶性肿瘤的预后相关[4]。IL-6与白细胞介素6受体(IL-6receptor,IL-6R)结合可激活细胞表面gp130亚基,进而激活JAK/STAT、PI3K/AKT、IL-6/STAT3信号通路[5]。本研究通过制备Lewis肺癌小鼠模型,探究Dex对患鼠免疫功能的影响并分析其对IL-6/STAT3信号通路的调控作用,以期为肺癌的综合治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1实验动物

近交系C57BL/6J小鼠72只,雄性,SPF级,10周龄,体质量20～30g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Lewis肺癌细胞株,由中国医科大学基础医学院免疫学教研室提供。本研究经山东潍坊市益都中心医院医学伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器

Dex注射液(100μg/mL),购自四川科伦药业股份有限公司;顺铂注射液,购自江苏豪森药业集团有限公司;碘化丙啶,购自苏州宇恒生物科技有限公司;TNF-α、IL-6ELISA检测试剂盒,购自上海邦奕生物科技有限公司;抗IL-6、STAT3、p-STAT3单克隆抗体,购自SantaCruz公司。iMark酶标仪,来自Bio-Rad公司;5810R高速冷冻离心机,来自Eppendorf公司;HERAcell240i37℃恒温CO2培养箱,来自Thermo Fisher Scientific公司;Tanob-4500凝胶成像系统,来自Invitrogen公司。

1.3建模与分组

小鼠随机分为6组,每组12只,分别为对照组(N组):正常饲养,不做任何处理;假手术组(S组):构建Lewis肺癌小鼠模型时只注射0.2mL生理盐水,不做其他处理;模型组(M组):参考文献[6]建立Lewis肺癌小鼠模型,具体为用含10%FCS的RPMI1640培养液培养Lewis肺癌细胞,取对数生长期细胞并调整密度为1×107个/mL。小鼠适应性饲喂1w后,随机选取48只于右腋皮下注射0.2mLLewis肺癌细胞悬液,观察肿瘤生长情况。约D8可触及肿块,说明造模成功,D10开始给药处理。另3组为Dex组(D组):分别于D10、D12、D14瘤旁注射Dex,剂量为1μg/kg;顺铂组(C组):分别于D10、D12、D14瘤旁注射顺铂(以6.15mg/kg剂量溶于0.2mL生理盐水);Dex联合顺铂组(DC组):顺铂治疗的同时注射Dex,D10～D141次/d,连续注射5d。于D15收集外周血样本后颈椎脱臼处死小鼠,无菌分离肿瘤、脾脏及胸腺组织。

1.4小鼠瘤质量、瘤体积及肿瘤细胞凋亡率的检测

无菌条件下分离瘤组织并称重。取适量瘤组织,切碎并置于120目不锈钢滤网上;下方放置平皿,用眼科镊揉搓组织块,并用RPMI1640培养液冲洗直至揉碎组织块;用300目铜网过滤平皿中混悬液,去除细胞团块,用PBS冲洗获得单细胞悬液;调整细胞密度至1×109个/mL,加入200μLPI(50mg/L),FACS检测细胞凋亡率。

1.5小鼠脾脏、胸腺指数的计算

无菌条件下称重小鼠脾脏、胸腺组织,按以下公式计算脾脏、胸腺指数:

脾脏指数=脾脏重量(mg)/体质量(g)

胸腺指数=胸腺重量(mg)/体质量(g)

1.6小鼠淋巴细胞、白细胞(whitebloodcell,WBC)、骨髓细胞(bonemarrowcell,BMC)计数

血细胞计数仪常规计数小鼠外周血淋巴细胞、WBC。分离小鼠股骨,PBS冲洗骨髓腔,离心收集细胞沉淀并加入0.2mLPBS混匀,光镜下计数单根股骨BMC。

1.7MTT法检测淋巴细胞增殖活性

取脾脏组织制备淋巴细胞悬液,以1×106个/孔接种于96孔板,加入ConA(5mg/mL)培养48h;每孔加入20μLMTT溶液,孵育4h后弃去培养液,酶标仪检测D(490nm)。

1.8小鼠外周血TNF-α、IL-6表达水平及瘤组织IL-6、p-STAT3、STAT3蛋白的测定

分离获得小鼠外周血血清,ELISA检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6水平,具体操作参考试剂盒说明书。Westernblotting检测瘤组织IL-6、p-STAT3、STAT3、β-actin(内参)蛋白表达,采用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.9统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计分析,正态分布定量资料以ˉx±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用SNK-q检验。结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1小鼠生存状态评估

研究过程中N组、S组、DC组未见小鼠死亡,M组小鼠于成瘤后D7、D9各死亡1只,D组于成瘤后D9死亡1只,C组于D8死亡1只。治疗5d后,N组、S组、DC组各剩余12只,M组剩余10只,D组、C组各剩余11只。

2.2小鼠瘤质量、瘤体积、肿瘤细胞凋亡率检测

M组、D组间瘤质量、瘤体积及肿瘤细胞凋亡率差异无统计学意义,与D组比较,C组、DC组瘤质量、瘤体积均显著减少,肿瘤细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。(图1、图2)

图1各组小鼠瘤质量、瘤体积、肿瘤细胞凋亡率比较

注:与M组比较,*P<0.05;与D组比较,#P<0.05

2.3小鼠体质量、脾脏、胸腺指数、WBC和淋巴细胞计数

与S组比较,M组脾脏、胸腺指数均显著升高(P<0.05);与M组比较,D组、C组、DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数均显著减少(P<0.05);与D组比较,C组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数、BMC均显著减少(P<0.05);与C组比较,DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数、BMC均显著升高(P<0.05)。(图3)

图2肿瘤细胞凋亡率检测

图3各组小鼠免疫状态比较

注:与S组比较,*P<0.05;与M组比较,#P<0.05;与D组比较,△P<0.05;与C组比较,▲P<0.05

2.4小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性及血清IL-6、TNF-α水平检测

与S组比较,M组淋巴细胞增殖活性、血清IL-6水平显著升高,TNF-α水平显著降低(P<0.05);与M组比较,D组、C组、DC组淋巴细胞增殖活性、IL-6水平显著降低,TNF-α水平显著升高(P<0.05);与D组比较,C组、DC组小鼠淋巴细胞增殖活性显著降低(P<0.05),IL-6水平显著升高(P<0.05),TNF-α水平有显著差异(P<0.05);与C组比较,DC组小鼠淋巴细胞增殖活性、血清TNF-α水平显著升高,IL-6水平显著降低(P<0.05)。(图4、图5)

2.5肿瘤组织中IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量检测

与M组比较,D组、C组、DC组肿瘤组织中IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量依次显著降低(图6,P<0.05)。

图4各组小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性比较

注:与S组比较,*P<0.05;与M组比较,#P<0.05;与D组比较,△P<0.05;与C组比较,▲P<0.05

图5各组小鼠血清IL-6、TNF-α水平比较

注:与S组比较,*P<0.05;与M组比较,#P<0.05;与D组比较,△P<0.05;与C组比较,▲P<0.05

图6各组小鼠肿瘤组织中IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量比较

注:与M组比较,*P<0.05;与D组比较,#P<0.05;与C组比较,△P<0.05

3、讨论

Dex是一种选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇静作用[7]。本研究显示,D组瘤质量、瘤体积、肿瘤细胞凋亡率与M组相比差异无统计学意义,C组、DC组瘤质量、瘤体积较M组显著降低,瘤细胞凋亡率显著升高,提示Dex本身对瘤细胞无显著影响。顺铂可通过破坏DNA功能抑制肿瘤细胞有丝分裂,具有广谱抗肿瘤效果,为临床治疗肺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种实体瘤一线用药,但对机体有一定毒性,患者可出现免疫抑制反应[8]。本研究结果显示,与M组比较,D组、C组、DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数均显著降低;与C组比较,DC组脾脏、胸腺指数、WBC、淋巴细胞计数、BMC显著升高。脾脏是T、B细胞清除血源性抗原的重要外周免疫器官,胸腺是T细胞发育、分化、成熟的主要场所,胸腺和脾脏的状态是否正常是机体正常发挥免疫功能的关键[9]。以上提示Dex对顺铂治疗小鼠的胸腺、脾脏具有明显保护作用,可促进机体免疫功能,可能通过促进T细胞分化、发育,增强淋巴细胞抗肿瘤免疫应答。

TNF-α主要由巨噬细胞及活化的T细胞分泌,其可促进APC对肿瘤抗原的提呈,在机体抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用[10]。本研究显示,与S组比较,M组IL-6水平显著升高,TNF-α水平显著降低;与M组比较,D、C组淋巴细胞增殖活性、IL-6水平显著降低,TNF-α水平显著升高;与C组比较,DC组小鼠淋巴细胞增殖活性、血清TNF-α水平显著升高,IL-6水平显著降低,提示Dex联合顺铂可减轻化疗抗肿瘤引起的免疫抑制反应。IL-6与可溶性IL-6R结合可激活多条炎症通路。两者结合后可激活细胞表面gp130亚基,进而激活IL-6/STAT3信号通路。研究报道,Dex可通过抑制JAK2/STAT3信号通路改善LPS诱导的小鼠急性肺损伤[11]。本研究中,与M组比较,D组、C组、DC组IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达量依次下降,提示Dex可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路激活抑制IL-6释放,进而减轻顺铂抗肿瘤过程引起的免疫功能抑制。

综上所述,Dex联合顺铂对肺癌小鼠的胸腺、脾脏、骨髓具有明显保护作用,可促进Lewis肺癌小鼠脾脏、胸腺指数、淋巴细胞计数增加,减轻顺铂对Lewis肺癌小鼠的免疫抑制功能,可能与抑制IL-6/STAT3信号通路激活有关。但关于Dex对肺癌小鼠的具体免疫保护机制尚不明确,有待进一步研究。

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基金:2017年山东省自然科学基金(ZR201709200273).