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山竹果皮提取物抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

2020-09-27 231 上传者：管理员

摘要：目的探讨山竹果皮提取物是否通过调控SPOCK1表达影响非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。方法用不同终浓度(100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)的山竹果皮提取物处理A549细胞24h,CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力,qRT-PCR和Westernblot检测SPOCK1mRNA和SPOCK1蛋白的表达。建立抑制SPOCK1表达A549细胞株,观察其对A549细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。建立过表达SPOCK1的A549细胞株,然后再给予山竹果皮提取物(400μmol/L)处理24h,观察其对A549细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果山竹果皮提取物呈剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制SPOCK1的表达(P<0.05))。抑制SPOCK1表达可抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。过表达SPOCK1可逆转山竹果皮提取物对A549细胞增殖、迁移侵袭的抑制作用(P<0.05)。结论山竹果皮提取物通过下调SPOCK1从而抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

关键词：
SPOCK1
侵袭
增殖
山竹果皮提取物
细胞增殖
肺癌
迁移
非小细胞肺癌
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目前的数据表明,非小细胞肺癌发病率和病死率高,约占所有肺癌死亡率的80%,临床上多采用手术、放化疗和免疫治疗相结合的治疗方式,但由于其预后较差,5年生存率仍低于16%[1,2]。从天然中药中寻找高效低毒的新型抗肿瘤药物是目前的研究热点。已有的研究表明,山竹果皮提取物中的氧杂蒽酮衍生物具有明显的抗菌、抗炎和抗肿瘤作用[3,4,5]。细胞外基质蛋白多糖基因1(SPOCK1)作为一种癌基因,在前列腺癌和结肠癌多种肿瘤组织和细胞中表达上调[6,7,8],而下调SPOCK1可显著抑制癌细胞的活性和迁移能力。但山竹果皮提取物是否对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移侵袭有影响,且山竹果皮提取物是否通过调控SPOCK1的表达影响非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭目前笔者尚未查到确切资料。因此,本研究通过山竹果皮提取物体外干预非小细胞肺癌细胞A549及调节细胞中SPOCK1基因的表达,观察细胞的增殖、迁移和侵袭能力,为临床治疗提供实验基础。

1、材料与方法

1.1实验材料

非小细胞肺癌细胞株A549购于美国ATCC;DMEM完全培养基购于Gibco公司;胎牛血清购于Hyclone公司;山竹果皮粉购于斯唯诺生物;RIPA裂解液、CCK-8试剂盒和Westernblot相关试剂购于碧云天公司;Transwell小室和Matrigel购于BD公司;PCR引物、si-NC、si-SPOCK1、pcDNA和pcDNA-SPOCK1的构建和测序由上海生工公司提供;SPOCK1、CyclinD1、P21、MMP-2、MMP-9和MMP-14抗体购于Abcam公司;P27、Bax、Bcl-2和GAPDH抗体购于SantaCruz公司;HRP标记的二抗购于武汉博士德。

1.2细胞转染

用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗)在37℃、CO2体积分数为5%的环境条件下培养非小细胞肺癌细胞株A549,取对数生长期的A549细胞用于后续实验。按细胞密度2×105个/孔将A549细胞接种于6孔板,当细胞达到50%然融合时,利用LipofectamineTM2000将si-NC、si-SPOCK1、pcDNA和pcDNA-SPOCK1分别转染A549细胞,转染48h后,用于后续实验研究。

1.3山竹提取物的制备

取山竹果皮干燥粉末50g,将其溶于500ml的85%乙醇中,16h后,过滤取上清液,旋蒸至10ml,用乙酸乙酯萃取,取上清液过硅胶柱,用正己烷和乙酸乙酯按照5∶1比例洗脱,将得到的液体烘干,用DMSO溶解后,放置于-20℃冰箱冷冻保存备用[9,10]。

1.4分组及处理

将A549细胞随机分为以下几组:NC组(对照组,正常培养的A549细胞)、山竹果皮提取物组(分别给予用细胞培养液稀释的终浓度[9]为100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L的山竹果皮提取物处理24h)、si-NC组(转染si-NC)、si-SPOCK1组(转染si-SPOCK1)、山竹果皮提取物+pcDNA组(转染pcDNA48h后,用终浓度为400μmol/L的山竹果皮提取物处理24h)和山竹果皮提取物+pcDNA-SPOCK1组(转染pcDNA-SPOCK148h后,用终浓度为400μmol/L的山竹果皮提取物处理24h)。

1.5qRT-PCR检测

分别提取(用TRIzol试剂)各组细胞A549的总RNA,并检测其浓度和纯度。利用逆转录酶将其逆转录为cDNA,并以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。以GAPDH为内参,用2-ΔΔCt法计算SPOCK1mRNA的相对表达量。引物序列如下:SPOCK1-F:5’-CCCGTTACTGCCGGTGATTA-3’;SPOCK1-R:5’-CCAGGTCTGGACAAGCTGAG-3’;GAPDH-F:5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’;GAPDH-R:5’-AAAGGGTGTAACGCAACT-A-3’。

1.6MTT法检测细胞活力

按照1×104个/孔的细胞密度将A549细胞接种于96孔板,培养24h后,按照1.4分组处理至规定时间后,每孔加入2.5g/L的CCK-8溶液10μl,孵育2h后,在450nm波长处用酶标仪测定各孔的吸光度值。

1.7Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力

(1)迁移实验:用胰酶消化各组处理至规定时间的细胞,离心收集各组细胞,然后用不含血清的DMEM培养基重悬细胞,调整细胞浓度至2×105个/ml。向Transwell下室内加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培养基,向Transwell上室加入200μl的细胞悬液,随后将装有Transwell小室的96孔板放置于细胞培养箱中(37℃,CO2体积分数为5%)培养24h,擦去上室膜上未迁移的细胞后,直接用0.1%结晶紫进行染色20min,用PBS冲洗多余的染液后,将Transwell小室倒置于显微镜下随机选取5个不同视野,观察、拍照记录细胞总数,以其均值作为迁移细胞数。(2)侵袭实验:用50mg/L的Matrigel按1∶8稀释包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃风干后备用,其他步骤同上。

1.8Westernblot检测

用RIPA裂解液裂解处理好的细胞,4℃,12000r/min离心5min,收集上清液,获得各组细胞蛋白样品。用BCA试剂盒测定各组蛋白样品的浓度,加入2×的蛋白上样缓冲液,沸水浴3min,取30μg已冷却的变性蛋白样品进行上样。经SDS-PAGE电泳分离细胞蛋白后,将已分离的细胞蛋白全部转移至PVDF膜。将PVDF膜置于WesternBlot封闭液中室温封闭30min,吸尽封闭液并洗膜后,加入已稀释的抗SPOCK1、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白及GAPDH的一抗,4℃孵育过夜后,WesternBlot洗膜3次,5min/次,吸尽封闭液后,加入已稀释的二抗,室温孵育1h,WesternBlot再次洗膜3次,5min/次,然后将PVDF膜正面向上放置于暗盒内,加入显影液,检测蛋白的相对表达量。

1.9统计学分析

应用SPSS20.0统计软件,计量资料以x¯±s表示,采用t检验,多组间比较用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响

使用不同浓度的(100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)山竹果皮提取物预处理A549细胞24h,后以CCK-8法检测细胞增殖活力,结果显示,随着山竹果皮提取物浓度的增加,A549细胞增殖被显著抑制,并呈显著剂量依赖性(P<0.05)。Westernblot法检测增殖相关蛋白的表达,结果显示,山竹果皮提取物呈剂量依赖性地抑制CyclinD1的表达,促进p21和p27的表达(P<0.05)。见表1,图1。

2.2山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响

使用不同浓度的(100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L)山竹果皮提取物预处理A549细胞24h,Transwell法检测A549细胞迁移和侵袭细胞数,结果显示,山竹果皮提取物呈剂量依赖性地抑制A549细胞迁移和侵袭(P<0.05)。Westernblot法检测迁移侵袭相关蛋白表达,结果显示,山竹果皮提取物呈剂量依赖性地抑制MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白的表达(P<0.05)。见表2,图2。

表1山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞增殖的影响n=12,x¯±s

注:与对照组比较,*P<0.05;与山竹果皮提取物100μmol/L组比较,#P<0.05;与山竹果皮提取物200μmol/L组比较,△P<0.05

图1增殖相关蛋白表达

2.3山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞中SPOCK1表达的影响

结果显示,山竹果皮提取物呈剂量依赖性地SPOCK1mRNA和SPOCK1蛋白的表达(P<0.05)。见图3,表3。

表2山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响n=12,x¯±s

注:与对照组比较,*P<0.05;与山竹果皮提取物100μmol/L组比较,#P<0.05;与山竹果皮提取物200μmol/L组比较,△P<0.05

图2山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响

A迁移侵袭相关蛋白表达;BA549细胞的迁移侵袭

图3SPOCK1蛋白表达

表3山竹果皮提取物对非小细胞肺癌A549细胞中SPOCK1表达的影响n=12,x¯±s

注:与对照组比较,*P<0.05;与山竹果皮提取物100μmol/L组比较,#P<0.05;与山竹果皮提取物200μmol/L组比较,△P<0.05

2.4抑制SPOCK1表达对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

与si-NC组相比,si-SPOCK1组A549细胞SPOCK1蛋白的表达显著降低,细胞增殖抑制率显著升高,迁移和侵袭细胞数显著降低,CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著降低,p21蛋白的表达显著升高(P<0.05)。见表4,图4。

2.5SPOCK1过表达逆转了山竹果皮提取物对A549细胞增殖、迁移侵袭的作用

与对照组比较,山竹果皮提取物组A549细胞增殖抑制率显著升高,迁移和侵袭细胞数显著降低,SPOCK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著降低,p21蛋白的表达显著升高;与山竹果皮提取物+pcDNA组比较,山竹果皮提取物+pcDNA-SPOCK1组A549细胞增殖抑制率显著降低,迁移和侵袭细胞数显著增多,SPOCK1、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达显著升高,p21蛋白的表达显著降低(P<0.05)。见图5,表5。

表4抑制SPOCK1表达对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响n=6,x¯±s

注:与miR-NC组比较,*P<0.05

图4SPOCK1和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

图5SPOCK1和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表5SPOCK1过表达逆转了山竹果皮提取物对A549细胞增殖、迁移侵袭的作用n=12,x¯±s

注:与对照组比较,*P<0.05;与山竹果皮提取物+pcDNA组比较,#P<0.05

3、讨论

山竹果皮提取物由于含有多种氧杂蒽酮衍生物,其抗肿瘤作用于2004年被首次提出[11]。研究发现,山竹果皮提取物具有抑制胃癌[12]、肝癌[9]和鼻咽癌[10]细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,其抗肿瘤作用可能与抑制癌细胞进入S期和激活Caspase-3有关。SPOCK1是钙离子结合蛋白多糖家族成员,既往研究发现,SPOCK1在调控细胞周期、细胞凋亡、DNA修复和细胞转移等方面发挥着重要作用[13]。例如,SPOCK1在卵巢癌和膀胱癌中呈高表达,抑制SPOCK1可抑制卵巢癌和膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力[14,15];过表达SPOCK1通过激活PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信号通路促进神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[16]。以上研究表明,山竹果皮提取物具有抗肿瘤的潜在活性,SPOCK1在调控肿瘤细胞增殖和转移中发挥重要作用。

本研究结果显示山竹果皮提取物能有效的抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,且这种抑制作用呈明显的剂量依赖性。此外,本研究观察了山竹果皮提取物对癌基因SPOCK1表达的影响,发现山竹果皮提取物呈浓度依赖性地抑制SPOCK1mRNA和SPOCK1蛋白的表达。SPOCK1可导致正常细胞外基质蛋白退化,调节细胞外基质的重构,细胞环境的改变促进了肿瘤细胞的恶性转移[17]。随后构建了抑制SPOCK1表达的A549细胞株,发现抑制SPOCK1表达可显著抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,与蒲江涛等[18]的研究结果相吻合。因此,我们猜测山竹果皮提取物通过下调SPOCK1表达,从而调控相关信号通路,从而抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭。为进一步验证山竹果皮提取物是通过调控SPOCK1表达发挥调控A549细胞的增殖、迁移和侵袭的作用,在A549细胞转染pcDNA-SPOCK1质粒后,用山竹果皮提取物进行干预处理,结果显示,SPOCK1过表达可部分逆转山竹果皮提取物对A549细胞增殖、迁移侵袭的抑制作用。提示,山竹果皮提取物通过下调SPOCK1的表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述,本研究通过体外细胞实验证实山竹果皮提取物通过下调SPOCK1具有抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的潜在活性,这为其开发成新型抗肿瘤药物、早日用于临床治疗奠定了实验基础。

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