肺癌是世界第一大癌症,随着每年发病率的上升,死亡率高居恶性肿瘤首位,且女性患者数量也呈逐年上升趋势[1,2,3,4]。研究肺癌发生和发展的分子生物学机制,为肺癌的分子诊断和治疗提供新的靶点已成为其基础研究的热点。大量研究表明,在肺癌中miRNA通过调控下游基因控制癌细胞的增殖、迁移和侵袭及耐药性等[5,6,7]。miR-9-5p是一种高度保守的微小RNA,主要表达于中枢神经系统[8],并调节其正常发育。miR-9-5p在宫颈癌、舌癌、乳腺癌中表达异常,与癌细胞的增殖、转移、侵袭有关[9,10,11]。miR-9-5p在非小细胞肺癌患者血清中表达上调,是肺癌诊断的潜在标志物[12]。金属蛋白酶ADAMTS18[13]在多种肿瘤组织中表达异常,如食管鳞状细胞癌、宫颈癌癌、乳腺癌、肾透明细胞癌等[14,15,16,17,18]。ADAMTS18在肺癌组织中通常呈现甲基化,过表达ADAMTS18可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭[19]。miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌增殖、迁移和侵袭中都具有重要作用,而两者在肺癌中的关系尚不清楚。本课题拟研究miR-9-5p影响A549细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制及ADAMTS18在此机制中的作用,以期为肺癌的分子治疗提供新的靶标。

1、材料与方法

1.1材料

人肺癌细胞株A549和人正常支气管上皮细胞株HBE购自ATCC;胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自Gibco公司,牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亚砜(DMSO)和四氮唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司;Transwell板购自美国Corning公司;双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司;Lipofectamine2000转染试剂、TotalRNA提取试剂盒、real-timePCR试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司;抗ADAMTS18抗体和GAPDH抗体购自Abcam;显微镜、酶标仪及Real-timePCR仪购自美国Bio-Rad公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自Thermo。

1.2细胞培养

用含10%FBS、1%青-链霉素的DMEM培养基培养A549细胞,培养条件:37℃5%CO2培养箱中培养,湿度95%。培养细胞至对数生长期,消化传代。

1.3细胞转染

将对数生长期A549稀释至(1～2)×106个细胞/ml,200μl细胞/孔接种于6孔板中,细胞培养至融合度为80%～90%时进行转染。先用无血清OptiMEM培养液稀释脂质体、miR-NC、miR-9-5p、anti-miR-NC、anti-miR-9-5p、pcDNA、pcDNA-ADAMTS18、anti-miR-9-5p+si-NC、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18、WT-ADAMTS18+miR-NC、WT-ADAMTS18+miR-9-5p、MUT-ADAMTS18+miR-NC和MUT-ADAMTS18+miR-9-5p的载体,之后取等体积脂质体和各组载体混合,室温孵育20min,将混合液滴入到培养好的细胞孔板中,轻柔混匀,培养6h,换成完全培养基,转染48h后收集细胞。

1.4Real-timePCR检测mRNA表达

收集支气管上皮细胞和转染48h的各组A549细胞(anti-miR-NC、anti-miR-9-5p组),提取总RNA,保存于-80℃。然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA,反应程序为16℃30min、42℃30min、72℃10min;4℃放置10min,合成的cDNA测定浓度和纯度后置于-80℃保存。取cDNA按照real-timePCR的说明书进行反应,反应程序为:95℃6min;95℃30s、60℃40s、72℃45s,40个循环;72℃10min。引物如下:miR-9-5p上游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,下游:5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3′;ADAMTS18上游:5′-TGCACAACGGCAGGAAAAAG-3′,下游:5′-TCAAAATCGCCGAGGGCTTA-3′。运用Bio-RadPCR系统进行数据分析。

1.5MTT实验测定细胞活性

A549细胞转染48h后,收集细胞,Trypsin消化细胞,调整细胞浓度至1×104个/ml,200μl/孔接种于96微孔板中,继续培养,分别在24、48、72h进行MTT实验,每孔加入20μl(5mg/ml)MTT,培养4h,弃上清培养液,再在每孔加入150μlDMSO,室温混匀5min,酶标仪测定OD490nm吸光度(A)值。

1.6Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

迁移实验:转染后的各组A549细胞(anti-miR-NC组、anti-miR-9-5p组、pcDNA组、pcDNA-ADAMTS18组、anti-miR-9-5p+si-NC组、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组)培养至对数生长期,收集细胞,加入含10g/LBSA的无血清DMEM培养基,稀释细胞浓度为2×105个/ml。Transwell下层培养孔加入500μl10%FBS培养基作为迁移趋化物,Transwell上层小室中加入100μl细胞,将上层小室放入下层培养孔中,培养48h,用棉签拭去基质胶和上层小室的细胞,冰甲醛固定细胞,染色,显微镜观察计数。侵袭实验:以4℃无血清培养基1∶5比例稀释Matrigel,加入上层Transwell小室,烘干,以下步骤同迁移实验,上层小室加入100μl细胞,下层加入500μl10%FBS培养基,培养48h,固定细胞,染色,计数。

1.7双荧光素酶报告实验

A549细胞转染48h,收集细胞,Trypsin消化,计数,以1×104个细胞/孔接种于24孔板中,继续培养24h,观察若细胞融合度达到80%～90%,进行转染,分别构建ADAMTS18的野生型(WT-ADAMTS18)和突变型(MUT-ADAMTS18)双荧光素酶报告载体,分别共转染miR-NC或miR-9-5p,转染后培养48h,收集细胞,用裂解缓冲液室温裂解20min,离心收集上清,-20℃保存或直接加入荧光素酶底物,发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照,计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.8Western印迹实验

将HBE细胞和转染48h后的各组A549细胞用RIPA裂解液裂解,冰浴超声破碎细胞,收集蛋白并检测浓度。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,室温封闭1h,加入一抗ADAMTS18(1∶1000),4℃孵育过夜。洗膜2次,然后加入的二抗(1∶1000),室温孵育1h。以GAPDH为内参照,分析蛋白水平。

1.9统计学处理

采用SPSS21.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2、结果

2.1miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌A549细胞和人正常支气管上皮细胞HBE中的表达

Western印迹和qRT-PCR结果表明,与人正常支气管上皮细胞HBE相比,在肺癌细胞A549组中ADAMTS18的mRNA和蛋白表达量显著下降(P<0.05),而miR-9-5p表达量显著上升(P<0.05),见图1和表1。

图1检测ADAMTS18在肺癌A549细胞和人正常支气管上皮细胞HBE中的表达

2.2抑制miR-9-5p可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭

qRT-PCR结果表明,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-9-5p组miR-9-5p表达量显著下降(P<0.05)。MTT实验结果表明,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-9-5p组的细胞活性(OD490nm)在作用48、72h显著下降(P<0.05)。Transwell实验结果显示,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-9-5p组A549迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2抑制miR-9-5p对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响(x¯¯±s,n=3)

2.3miR-9-5p靶向调控ADAMTS18的表达

Targetscan软件预测结果显示,ADAMTS18的3′-UTR序列中含有与miR-9-5p互补的核苷酸序列,见图2。双荧光素酶报告系统结果显示,与miR-NC组相比,miR-9-5p组野生型WT-ADAMTS18的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05);而突变型MUT-ADAMTS18的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化(P>0.05)。Western印迹结果表明,与miR-NC组(0.42±0.04)相比,miR-9-5p组ADAMTS18蛋白表达量(0.19±0.03)显著下降(P<0.05);与anti-miR-NC组(0.37±0.04)相比,anti-miR-9-5p组ADAMTS18蛋白表达量(0.84±0.08)显著上升(P<0.05),见表3和图3。

图2ADAMTS18的3’UTR中含有与

miR-9-5p互补的核苷酸序列

图2ADAMTS18的3’UTR中含有与miR-9-5p互补的核苷酸序列

图3ADAMTS18蛋白表达

2.4ADAMTS18过表达抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭

Western印迹结果发现,与pcDNA组相比,pcDNA-ADAMTS18组ADAMTS18蛋白表达显著下降,见图4。qRT-PCR结果发现,与pcDNA组相比,pcDNA-ADAMTS18组ADAMTS18mRNA表达显著上升(P<0.05)。MTT实验和Transwell实验结果显示,与pcDNA组相比,pcDNA-ADAMTS18组A549细胞活性在作用48、72h显著降低(P<0.05),迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降(P<0.05),见表4。

图4检测肺癌A549细胞中ADAMTS18蛋白的表达

表4过表达ADAMTS18对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响(x¯¯±s,n=3)

2.5抑制ADAMTS18表达逆转了抑制miR-9-5p对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

Western印迹结果发现,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-9-5p组ADAMTS18蛋白表达显著上升(P<0.05),与anti-miR-9-5p+si-NC组相比,anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组ADAMTS18蛋白表达显著下降(P<0.05)。MTT和Transwell结果显示,与anti-miR-NC组相比,anti-miR-9-5p组A549细胞活性在作用48h和72h显著下降(P<0.05),迁移和侵袭细胞数均显著下降(P<0.05);与anti-miR-9-5p+si-NC组相比,an-ti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组A549细胞活性在作用48h和72h时显著上升(P<0.05),迁移和侵袭细胞数均显著上升(P<0.05)。见表5,图5。

表5抑制ADAMTS18表达逆转了抑制miR-9-5p对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用(x¯¯±s,n=3)

与anti-miR-NC组比较:1)P<0.05;与anti-miR-9-5p+si-NC组比较:2)P<0.05

图5ADAMTS18蛋白表达

1～4:anti-miR-NC组、anti-miR-9-5p组、anti-miR-9-5p+si-NC组、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组

3、讨论

随着环境污染的加剧,吸烟人口的低龄化,2015年我国的肺癌新发病例数约55.8万例,且死亡病例数约49.5万例,肺癌发病率逐年上升,患者5年生存率极低[1,2,3,4]。研究肺癌发生、转移机制,对肺癌诊断和治疗具有指导意义。

研究表明,miRNA参与肺癌发生和发展全过程,并与肺癌的预后和耐药性有关[5,6,7]。作为一种高度保守的miRNA,miR-9-5p最早发现于神经系统,调控神经系统正常发育,近年来发现其在多种癌症中异常表达,且与癌症的发展有关[8]。Xie等[9]发现,在宫颈癌中,miR-9-5p是lncRNANEAT1的靶向结合位点,与癌细胞的增殖迁移有关。陈伟泉等[10]研究表明,miR-9-5p在舌癌组织中表达量显著上调,通过靶向抑制Ambral表达进而促进舌癌细胞增殖。Barbano等[11]发现,在乳腺癌中,miR-9-5p表达上调,与癌细胞的转移、侵袭和患者不良预后有关,miR-9-5p的上调是表观遗传机制和雌性激素调节途径之间相互作用的结果。Yang等[12]研究发现,在中国云南宣威市,miR-9-5p在非小细胞肺癌患者血清中表达上调,是非小细胞肺癌诊断的潜在标志物。本研究结果表明,与人正常支气管上皮细胞HBE相比,miR-9-5p在肺癌A549细胞中显著上调,与Yang等[12]的研究结果一致,而抑制miR-9-5p表达可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭,证实了miR-9-5p在癌症发展中的作用。

ADAMTS18是含血小板结合蛋白基序的解聚素金属蛋白酶的一种,与肿瘤的血管生成和侵袭性密切相关,在多种肿瘤组织中表达异常[13,15,20,21]。郭丽丽等[14]发现,在食管鳞状细胞癌中,ADAMTS18表达量显著低于癌旁组织,与肿瘤的发生和分化程度有关。

在宫颈癌中,ADAMTS18表达下调[16]。Xu等[17]研究表明,ADAMTS18在肾透明细胞癌中表达下调,且呈高甲基化。Xu等[18]发现,ADAMTS18在乳腺癌中表达下调,过表达ADAMTS18可抑制癌细胞迁移和侵袭。Zhang等[19]发现,ADAMTS18在肺癌组织中通常呈现甲基化,过表达ADAMTS18可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,ADAMTS18通过抑制EGFR/AKT信号传导,增强肺癌细胞对顺铂的敏感性。本研究证实,ADAMTS18在肺癌A549细胞中的表达量显著下降,过表达ADAMTS18可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭。

此外,Targetscan软件预测结果暗示miR-9-5p与ADAMTS18之间可能存在结合位点或调控关系。通过Western印迹和双荧光素酶报告系统结果发现,miR-9-5p靶向负调控ADAMTS18的表达,抑制ADAMTS18逆转了下调miR-9-5p对A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。本研究证实了在非小细胞肺癌中miR-9-5p和ADAMTS18之间的调控关系。

本研究首次阐述了miR-9-5p在非小细胞肺癌A549细胞中靶向负调控ADAMTS18的表达,进而抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭。miR-9-5p有望成为非小细胞肺癌诊断和治疗的分子生物学靶点,对肺癌的诊断和治疗提供了新的研究方向。

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