肺癌是世界范围内最常见的癌症相关死亡原因之一[1],而吸烟是导致肺癌的最大单一风险因素，研究表明75%～90%的肺癌与吸烟相关[2,3]。尽管吸烟导致肺癌分子机制研究取得巨大进展，但目前为止仍然有许多机制还不清楚[4]。烟草是一个化学混合物，它包含超过5 000种以上的化学物质，其中被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)鉴定的致癌物有73种，与肺癌相关的超过20种以上，这些包括多环芳香烃类如苯并芘、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)等[5]。吸烟致肺癌的机制主要包括与DNA形成加合物导致错配复制继而引起后续基因改变如p53、KRAS突变等，与细胞表面受体结合激活AKT、PKA等基因致凋亡能力下降，烟草直接抑制抑癌基因的活性，破坏了抑癌基因与致癌基因活性的平衡，但最主要的原因还是DNA加合物的形成。在烟草肺癌相关致癌物中苯并芘是被研究最多的致癌物，它主要通过与DNA形成加合物损伤DNA,在吸烟者的肺DNA中已检测出特异性的加合物[6]。DNA加合物可被细胞内的DNA修复系统(如核苷酸切除修复)所清除[7],有效的DNA修复可使细胞内的DNA加合物快速清除，DNA复制时，如果未修复的DNA损伤仍然存在，DNA聚合酶将于该处停止复制，从而阻止受损DNA的复制或细胞死亡。倘若DNA聚合酶越过DNA加合物，即可产生碱基错配而导致基因突变。DNA加合物的清除主要是通过核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)途径完成的，在这之中polδ发挥不可替代作用。polδ由4个亚基组成：包括催化亚基p125及其它3个亚基p50、p68、POLD4(p12)[8]。在我们前期研究中发现polδ最小亚基POLD4在小细胞肺癌及部分非小细胞肺癌中表达低下，且POLD4蛋白的缺失或通过siRNA下调它的表达量削弱了polδ复制功能及NER能力[9]。最近的研究表明POLD4在遭受紫外线、羟基脲或DNA复 制压力等时可引起POLD4降解，使4亚基的聚合酶polδ4向3亚基 的DNA聚合酶polδ3转化[10,11,12]。

众所周知，吸烟与肺癌关系密切，联系我们前期研究结果及最近报道使我们想到吸烟有没有可能引起POLD4表达下降，增加了致癌风险，最终导致肺癌形成呢?在本实验中，我们利用烟草中主要致癌物质苯并芘类似物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide, 4NQO)处理肺癌细胞株A549,观察POLD4的蛋白表达变化，并在A549细胞中利用siRNA技术下调POLD4表达量观察对4NQO的敏感性变化及在挽救实验中利用POLD4过表达稳定克隆等来阐释吸烟可能导致POLD4表达下降进而削弱DNA修复能力最终导致肺癌的机制。

1、材料与方法

1.1研究对象

肺癌细胞株A549购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。SK3细胞实验 于日本名古屋大学分子 肿瘤学科完成。细胞培养于5%RPMI 1640含胎牛血清培养液，放于37℃,5%CO2,20%O2细胞培养箱中培养。

1.2材料

4NQO购自SIGMA公司，POLD4抗体购自中国台北Abnova公司，α-tubulin购自Santa Cruz Biotechnology公司。POLD4 siRNA及阴性内参合成于中国广州市锐博生物科技有限公司。POLD4 siRNA序列为：正义：5'-GCAUCUCUAUCCCCUAUGATT-3',反义：5'-UCAUAGGGGAUAGAGAUGCTT-3';阴性内参序列为：正义：5'-C UUUAAGCUCCCUGACGUUU-3',反义：5'-ACGCUCAGGGAGCUUAAAGUG-3'。细胞转染液Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，MTT测定液TetraColor One®试剂盒购自日本Seikagaku公司。

1.3 Western blotting

A549细胞经不同浓度的4NQO(0μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L)处理48小时后用PBS轻洗3遍后加入细胞裂解液，经细胞铲收集总蛋白，用BSA试剂盒测定总蛋白浓度，每孔上样蛋白量30μg。采用湿法转膜将蛋白转到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭洗脱1小时，一抗4℃过夜培育，用PBS液洗膜3次后，二抗室温培育1小时，最 后用增强型化学发光 剂(ECL)显影、定影。α-tubulin作为实验内参。

1.4细胞的瞬时转染

转染前一天将对数生长期 的A549细胞接种于6孔板中，每孔接种5×105个细胞，设立siRNA-POLD4组及siRNA阴性对照组，根据Lipofectamine 2000说明书瞬时转染细胞，用于验证所用siRNA-POLD4能有效剔除A549细胞中POLD4蛋白表达。

1.5 MTT药敏试验

将转染siRNA-POLD4及siRNA阴性对照24小时后的A549细胞或SK3稳定克隆用0.25%胰酶消化后用5%RPMI 1640培养液制备成细胞悬液，以每孔8 000个细胞接种于96孔板上，每孔含200μL培养液。24小时培育后用含不同浓度药物[4NQO,紫杉醇(Taxol)]的培养液更换旧培养液，每个药物浓度设5个复孔，继续培育48小时后根据TetraColor One®试剂盒说明书处理细胞后在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的光密度(OD)值。试验中还设计了不含细胞的调零孔。重复实验3次。

2、结果

2.1 4NQO下调了肺癌细胞株A549的POLD4蛋白表达水平

之前的研究显示POLD4在受到如紫外线、羟基脲或DNA复制压力等时其表达量下降，表现为4亚基的DNA聚合酶polδ4向3亚基的DNA聚合酶polδ3转化。在本实验中肺癌细胞株A549经4NQO处理48小时后通过Western blotting检测POLD4的蛋白表达水平，我们发现A549细胞经4NQO处理后POLD4的蛋白表达量明显下降且与浓度呈正相关(图1)。

2.2 4NQO所致的POLD4低表达可能是通过泛素化途径引起

之前的文章报道POLD4在遭受DNA损伤出现的POLD4蛋白表达水平下降是由于泛素化修饰途径启动的蛋白水解。为明确4NQO引起的POLD4表达水平是否也是由这一途径引起，我们通过蛋白酶活性抑制剂MG132来干预经4NQO处理的细胞，结果发现蛋白酶活性抑制剂MG132能逆转4NQO处理后的POLD4蛋白表达水平(图2),表明4NQO所致的POLD4低 表达可能也是通过泛素化途径 引起。

2.3 POLD4低表达水平削弱了DNA的NER能力

4NQO能结合到DNA形成DNA加合物引起DNA损伤，为进一步探查POLD4表达水平是否与DNA的NER能力相关，我们应用siRNA干扰技术调节A549细胞的POLD4的表达水平，观察敲除POLD4或不敲除POLD4对4NQO及Taxol(其细胞损伤非通过核苷酸切除修复来修复)的影响，结果我们发现siPOLD4诱导的POLD4低表达增强了对4NQO的毒性的敏感性，间接反映了POLD4低表达削弱了DNA核苷酸切除修复能力，而POLD4的表达水平却与细胞对Taxol的敏感性无关(图3)。

图1 4NQO处理的肺癌细胞株A549的POLD4蛋白表达水平

Fig.1 The expression level of POLD4 protein in lung cancer cell line A549 treated with 4NQO

图2蛋白酶活性抑制剂MG132能逆转4NQO处理后的POLD4蛋白低表达水平

Fig.2 The protease active inhibitor MG132 can reverse the low expression level of POLD4 after 4NQO treatment

图3 POLD4低表达水平削弱了DNA的NER能力

Fig.3 Low POLD4 expression impaired DNA NER ability

A：在A549细胞中siRNA-POLD4转染下调了POLD4蛋白表达水平；B-C:siRNA-POLD4诱导的POLD4低表达增强了对4NQO的毒性的敏感性，而不影响细胞对Taxol的敏感性（*P<0.05,**P<0.01.ns：差异无统计学意义）。

A:The expression level of POLD4 protein was down-regulated by siRNA-POLD4 transfection in A549 cells.B-C:Low POLD4 expression inducedby siRNA-POLD4 enhanced the sensitivity to toxicity of 4NQO without affecting the sensitivity of cells to Taxol(*P<0.05,**P<0.01.ns:Nosignificance).

2.4 POLD4过表达逆转了DNA的NER能力

利用我们实验中构建的Flag-POLD4-pcDNA3质粒稳定转染POLD4低表达的小细胞肺癌细胞株SK3,得到POLD4过表达的稳定克隆D4-1及D4-2。在MTT实验中我们可以看到POLD4过表达的质粒(D4-1、D4-2)增强了对4NQO的耐受性，意味着增强了DNA的NER能力(图4)。

3、讨论

在前期研究中，我们发现polδ最小亚基POLD4的蛋白表达量在小细胞肺癌及部分非小细胞肺癌的细胞系或临床标本中相对于正常标本都呈特异性低表达[9]。临床资料表明几乎所有的小细胞肺癌都有吸烟史，这是否意味着POLD4这 个基因在吸烟与肺癌特别是小细胞肺癌 之间存在相关?

烟草中含有的肺癌相关的致癌物超过20种以上，其中最主要的致癌物包括多环芳香烃类如苯并芘、NNK等。多环芳香烃类中苯并芘被研究的最多。本实验中我们采用苯并芘类似物4NQO来代替烟草中主要致癌物苯并芘。4NQO在自然条件下是不存在的，它是作为研究目的通过化学来合成的。它有潜在的细胞内氧化压力及它的代谢产物主要结合到DNA鸟氨酸残基上形成DNA加合物而发挥致癌性，与香烟中的苯并芘作用原理类似，因此它广泛应用于口腔癌动物模型的建立[10]。因4NQO为非气体物质，药物难以到达肺部的气管、支气管，所以肺癌的模型建立难以使用4NQO。在本实验中，我们利用4NQO致癌作用机理同烟草中主要致癌物质苯并芘类似的特点，在体外细胞实验中方便地选用了4NQO。

图4 POLD4过表达逆转了DNA的NER能力

Fig.4 POLD4 overexpression reversed the DNA NER ability

A:Western blotting证实Flag-POLD4-pcDNA3转染小细胞肺癌细胞株SK3后得到稳定克隆D4-1及D4-2;B:MTT实验揭示POLD4过表达增强了SK3细胞对4NQO的耐受性。Control:SK3细胞；Vector-1:Flag-pcDNA3质粒转染SK3细胞后得到的稳定克隆；Vector-2:Flag-pcDNA3转染SK3细胞后得到的另一稳定克隆；D4-1:Flag-POLD4-pcDNA3质粒转染SK3细胞后得到的稳定克隆；D4-2:Flag-POLD4-pcDNA3质粒转染SK3细胞后得到的另一稳定克隆；ns：差异无统计学意义。

A:Western blotting confirmed that D4-1 and D4-2 were stable clones of SK3 after Flag-POLD4-pcDNA3 was transfected with small cell lungcancer cell line SK3.B:MTT assay revealed that POLD4 overexpression enhanced the tolerance of SK3 cells to 4NQO.Control:SK3 cells.Vector-1:Stable clone of SK3 cells transfected with Flag-pcDNA3 plasmid.Vector-2:Another stable clone obtained after Flag-pcDNA3 transfection of SK3cells.D4-1:Stable clone of SK3 cells transfected with Flag-POLD4-pcDNA3 plasmid.D4-2:Another stable clone obtained after SK3 cells weretransfected with Flag-POLD4-pcDNA3 plasmid.ns:No significance.

最近的研究表明POLD4在遭受紫外线、羟基脲或DNA复制压力等时可引起POLD4降解，使4亚基的聚合酶polδ4向3亚基的DNA聚合酶polδ3转化，而这个转化是同泛素化途径降解POLD4途径实现的[11,12,13]。在我们前期研究中表明POLD4在小细胞及部分非小细胞肺癌中特异性表达低下的结果让我们想到吸烟与POLD4基因可能存在关联。结合以上两个研究结果，我们考虑是否吸烟可能导致POLD4表达下降从而增加致癌风险。结果表明，4NQO作用下使肺癌细胞株A549中的POLD4蛋白表达下降，这种蛋白下降通过蛋白酶活性抑制剂MG132能阻断，这个研究结果与他们结果相一致。因4NQO是通过作用于DNA与DNA形成加合物而致癌，机体主要通过polδ发挥NER来清除。根据这个特点，我们进一步探查了在A549中下调POLD4对NER能力的影响，结果表明下调的POLD4增强了对4NQO的敏感性，间接反映了下调的POLD4削弱了细胞的NER能力。

在本实验中我们选用了另外一种细胞毒性药物Taxol来作为对照，它引起的细胞毒性，细胞不是通过polδ发挥NER作用来修复的，因此并没有看到4NQO处理后导致的差异。为进一步明确POLD4在NER修复中的作用，我们利用POLD4低表达的小细胞肺癌细胞株SK3通过转染Flag-POLD4-pcDNA质粒后得到的稳定克隆进行了挽救实验，结果表明在POLD4过表达细胞株中呈现了对4NQO更好的耐受性，揭示POLD4低表达削弱了DNA的NER能力。MENG等人[11]的研究结果表明下调polδ亚基POLD4表达水平减弱DNA复制能力但增强了DNA校对、修复功能，而我们实验结果表明削弱了它的修复功能。对于这个问题，在我们前期的研究中，我们同样在体外实验中发现缺乏POLD4降低了DNA复制能力，并发现在肺癌细胞株中下调POLD4能使细胞阻滞在G1期延缓复制，并阐释了这种阻滞是通 过Skp2-p27途径实现的[9,14,15],这一点我们与其他研究单位的结果是一致的。在前期研究中，我们发现通过siRNA技术下调肺癌细胞株中的POLD4蛋白表达水平导致了细胞核的畸形[15],染色体断裂的增加并激活了周期检测点中代表DNA双键断裂的经典途径ATM-CHK2[9],这些说明下调POLD4表达水平引起了基因组不稳定，增加了致癌风险。而MENG等人[11]的研究表明缺乏POLD4的polδ增强了DNA校对、修复功能，与我们的研究结果存在分歧，这一点今后可能需进一步更多实验来验证，包括动物实验。

综上所述，我们认为烟草中重要致癌物质苯并芘下调了polδ中POLD4的表达水平，进而引起DNA修复功能之一的NER能力下降，进一步引起基因组不稳定，最终增加肺癌形成的风险。本实验为吸烟致肺癌的共识增加了一条理论证据，为戒烟宣传提供更有力的理论基础，也期望它能成为肺癌治疗的一个靶点。

文章来源：黄勤淼,刘燕辉,Motoshi Suzuki.POLD4在吸烟所致肺癌中作用机制的研究[J].现代肿瘤医学,2021,29(24):4271-4275.