从病理和治疗角度而言，原发性肺癌大致可以分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌约占80%～85%,包括腺癌、鳞癌等组织学亚型[1]。由于肺癌的早期筛查力度不够，大多数患者确诊时已经失去根治性手术机会[2]。在部分可手术Ⅲ期患者中，运用新辅助化疗可降低术前的T及N分期，从而提高根治性切除率，改善患者预后[2,3]。但仍有部分患者新辅助化疗不敏感，探究其中相关靶点及机制，对提高患者治疗精准性，改善患者预后情况有着重要意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)属于非编码核苷酸家族中最长的一个核苷酸亚基成员，其长度超过200个核苷酸，但它们并不编码蛋白质[4,5],其通过多种方式调节编码基因的转录水平，包括染色质结构、表观遗传、编码基因的转录、RNA的剪接、翻译等[6,7,8]。既往研究表明，lncRNA参与多种肿瘤的发生发展。 在非小细胞肺癌中，lncRNA可通过多种机制直接或间接影响肿瘤细胞的增殖、转移能力[9,10,11]。随着研究的深入，也发现了lncRNA与肿瘤新辅助化疗耐药相关[12,13,14],但lncRNA与非小细胞肺癌新辅助化疗耐药相关研究报道较少。本研究通过文库测序筛选出在非小细胞肺癌新辅助化疗耐药患者组织中差异表达的lncRNA POLG-DT,并探讨lncRNA POLG-DT在非小细胞肺癌新辅助化疗患者组织中的表达量，观察其对肺癌A549和NCI-H1299细胞功能的影响。

1、材料与方法

1.1材料

收集我院行新辅助化疗+根治性手术的非小细胞肺癌术后标本7例，所有手术均为同一团队完成，临床资料完整，患者均签署知情同意书。新辅助治疗疗效评估根据RECIST 1.1进行评价分组[15]。细胞系为肺癌A549和NCI-H1299,引物及si-RNA委托擎科生物科技有限公司设计及合成，RT-PCR仪购自美国罗氏公司，核酸染料购于翌圣生物，逆转录试剂盒购于愚公生物，RNA提取试剂盒购于诺唯赞科技有限公司，细胞周期检测试剂盒购于联科生物。

1.2实验方法

1.2.1 mRNA测序及文库构建

总RNA提取：采用动物总RNA提取试剂盒(磁珠法)#T102096进行分离，配对端文库按照TruSeq® RNA样品制备指南使用TruSeq® RNA样品制备试剂盒(Illumina, USA)合成。简而言之，用多聚T附着磁珠纯化含多聚A的mRNA分子。纯化后，将mRNA投入二价阳离子在95℃8 min裂解成小片段，用逆转录酶和随机引物将裂解后的RNA片段复制到第一链cDNA中；接下来是使用DNA聚合酶I和RNase H合成第二链cDNA,这些cDNA片段后经过末端修复过程，添加一个“A”碱基，然后连接适配器；然后用PCR对产物进行纯化和富集，形成最终的cDNA文库。纯化的文库使用Qubit® 2.0 Fluorometer(Life Technologies, USA)进行定量，并使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, USA)进行验证，以确认插入物尺寸并计算摩尔浓度。聚类由cBot生成，文库稀释至10 pmol/L,然后 在Illumina Noveseq 6000 (Illumina, USA)上测序。文库构建和测序在上海生物技术公司进行。

1.2.2 RT-PCR检测POLG-DT表达

提取总RNA后进行RNA反转录；cDNA合成：取模板RNA 500 ng,加入dsDNase 1μL,加入All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 4μL,将体系配至15μL,最后加入RNase free ddH2O使反应体系达到20μL,反应条件：37℃5 min; 55℃15 min; 85℃5 min。扩 增POLG-DT正义链：5'-AGACAGAACTCTCACCCACG-3',反义链：5'-AGTTTTACCTGGCGGCTCTG-3';GADPH正 义链：5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3',反义链：5'-GGAGTCCACTGGC GTCTTCA-3'。 反应条件：预变性95℃30 s,循环1次；变性95℃10 s,退火60℃20 s,延伸72℃20 s,循环40次；溶解曲线为仪器默认。

1.2.3细胞培养和转染

si-RNA细胞转染干扰序列为si-POLG-DT-1:5'-GGACUACAGAAGUUGACUU-3;si-POLG-DT-2:5' -G CCCAGCUGCACAGAUGAA-3';si-POLG-DT-3:5'-GCACGCAGAAUAAGGUCUA-3'。将细胞种入6孔板中，细胞密度要求大于70%进行转染；5μL lipo3000稀释于120μL的无血清RPMI 1640培养基中，混匀成A液，静置5 min;将5μL si-POLG-DT及si-NC分别稀释于120μL的无血清RPMI 1640培养基后，混匀成B液，静置5 min; A、B液室温下孵育20 min; 6孔板中加入完全培养基，再加入混合溶液，置于培养箱中培养48 h,消化离心用于下一步实验。

1.2.4划痕实验

胰酶消化收集细胞，根据细胞体积的大小向6孔板中加入适量体积转染后的细胞悬液，十字形晃动6孔板，使细胞分布均匀。24 h后，待细胞基本长满，使用短吸头在培养板中央垂直画一条直线，保持实验组和对照组的直线宽度大致相同。PBS洗涤细胞，直至无漂浮的细胞，加入培养基后，镜下拍照，记为0 h。对培养板表面进行酒精消毒，放入37℃培养箱中，观察0和24 h划痕宽度并拍照，ImageJ软件测量实验组和对照组细胞划痕面积，细胞迁移率(%)=(0 h面积-24 h面积)/0 h面积×100%。

1.2.5 Transwell实验

紫外灯照射24孔板和小室30 min。消化并收集细胞至离心管中，PBS洗涤两次，基础培养基悬浮细胞沉淀。细胞悬液充池，计数，加入实验所需体积细胞悬液于小室中，再补充无血清培养基，维持每个小室液体最终体积相同，向小室的下室加入新鲜的完全培养基，放入培养箱。48 h后从培养箱中取出小室，棉签擦干小室内的液体，放入多聚甲醛溶液中，固定时间为30 min。夹出小室，倒掉小室中的液体，放进结晶紫染色液中，染色时间为20 min。小室放入超纯水中漂洗，弃去小室内的液体，倒扣吹干残留液体，显微镜下拍照。

1.2.6集落形成实验

镜下观察转染后的细胞状态，胰 酶消化细胞，1 000 r/min,离心2 min。PBS重悬细胞沉淀，离心，转速和时间同上一步。新鲜培养基悬浮细胞沉淀，10μL细胞悬液充池，进行计数。以2 000个细胞/孔接种于6孔板中，37℃培养10～14天(每个细胞集落中细胞个数>100个为宜),弃去培养板中的旧培养基，PBS洗涤2次，多聚甲醛溶液1 mL/孔，固定细胞，时间为30 min,结晶紫染液1 mL/孔，染色时间为20 min,计数细胞集落个数。

1.2.7流式细胞术检测细胞周期

将干涉POLG-DT的si-RNA和 阴性对照分别转染NCI-1299肺癌细胞系，转染后继续培养72 h,然后收集细胞并计数，取1×105个细胞，经预冷的PBS洗涤后，向细胞沉淀中加入70%乙醇溶液重悬细胞，固定30 min,加入PI染色液，避光孵育30 min,然后进行流式细胞仪检测。

1.3统计学方法

Graphpad 9.0统计软件进行实验数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用n(%)表示，两组间计量资料采用t检验，多组计量资料采用方差分析。计数资料采用卡方检验，P<0.05表示差异存在统计学意义。

2、结果

2.1 POLG-DT在非小细胞肺癌新辅助化疗耐药患者组织中高表达

根据RECIST 1.1标准将收集病例分为新辅助化疗敏感组、耐药组，运用转录组测序技术对4例新辅助化疗敏感患者及3例新辅助化疗耐药患者术后标本进行测序。利用获得的基因表达计数文件对新辅助化疗敏感组及新辅助化疗耐药组，通过DEseq2包进行差异分析，获得差异表达的基因(见图1A)。 在其中，选取 相关差异表达的lncRNA,标准为P<0.02和|log2FC|≥1,结果显示：POLG-DT在新辅助化疗 耐药患者组织中表达 升高(log2FC=3.126 697 588,P=8.22E-05)。针对POLG-DT在TCGA肺癌数据库中进一步验证，我们发现相较于癌旁组织，POLG-DT在肺癌组织中高表达(见图1B)。

图1差异表达基因的筛选及表达  

A:热图(绿色：低表达水平；红色：高表达水平);B:POLG-DT在肿瘤组织和癌旁组织中的表达量比较。

2.2 POLG-DT在非小细胞肺癌细胞中高表达

RT-PCR结果显示，POLG-DT在非小细胞肺癌细胞系A549、NCI-H1299、NCI-H1975中的表达较肺上皮细胞系BEAS2B中表达升高(见图2A)。我们选定A549、NCI-H1299细胞系进行POLG-DT细胞 功能研究，并通过转染si-POLG-DT降低A549及NCI-H1299细胞中POLG-DT的表达水平(P<0.05,见图2B-C)。

2.3 POLG-DT对A549和NCI-H1299细胞增殖能力的影响

在CCK8实验中，NCI-1299-S2、A549-S2组细胞在2、3、4、5天时的增殖能力均低于正常对照组，平板克隆的结果提示相同的结果。表明敲低POLG-DT表达降低了A549和NCI-H1299细胞增殖能力(见图3)。

2.4 POLG-DT对A549和NCI-H1299细胞迁移和侵袭能力的影响

敲低POLG-DT的NCI-H1299细胞较si-NC组的迁移能力受到抑制(见图4A)。Transwell实验结果发现，敲低组细胞迁移数较si-NC组细胞迁移数减少(见图4B)。

2.5抑制POLG-DT对NCI-H1299细胞周期的影响

转染si-POLG-DT-2的NCI-H1299组与对照组相比，抑制POLG-DT表达后细胞出现G0/G1期阻滞(72.28% vs 53.99%),进入S期减少(20.60% vs 37.32%),见图5。

图2 POLG-DT在细胞系中的表达及其沉默验证  

A:不同细胞系中POLG-DT的基础量表达情况；B-C:转染POLG-DT siRNA的非小细胞肺癌细胞中POLG-DT的表达水平。与BEAS2B细胞比较，**P<0.01,***P<0.001。

图3敲低POLG-DT表达对A549和NCI-H1299细胞增殖能力的影响  

A:平板克隆实验；B:CCK8实验。

图4敲低POLG-DT表达对A549和NCI-H1299细胞迁移和侵袭能力的影响  

A:POLG-DT对NCI-H1299细胞迁移的影响；B:POLG-DT对NCI-H1299、A549细胞侵袭的影响(结晶紫染色×100)。

图5流式细胞术检测细胞周期  

3、讨论

非小细胞肺癌是常见的肿瘤类型，临床治疗策略多样，包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等，多种方式相互联合或序贯治疗的治疗策略也改善了患者的预后。非小细胞肺癌虽然治疗方式多样，但其5年生存率仅为16%[16],其中手术切除是治疗早期非小细胞肺癌的最佳方式[17]。但初治确诊分期为Ⅲa期和Ⅲb期晚期非小细胞肺癌患者却占非小细胞肺癌患者总体的30%[18],对于N1或淋巴结阴性的患者，手术仍是首选的治疗方式[19],而在淋巴结阳性Ⅲa-N2期患者中，单纯手术效果不佳，其局部复发率及远处转移率可高达60%以上[20]。采用术前化疗或放疗的新辅助治疗方式治疗后，可以部分缩小原发病灶体积，短期内降低肿瘤负荷，缓解肿瘤引起的各种并发症，也可为后续手术创造机会[21,22]。根据临床统计数据，新辅助化疗针对非小细胞肺癌的有效率在25%～74%,约19%～67%的患者通过新辅助化疗达到病理降期[23,24],部分新辅助化疗敏感的患者，可达到病理完全缓解[25,26]。因此，研究新辅助化疗耐药的机制可以为临床提供明确的分子靶点，为新辅助化疗提 供指征。

lncRNA是一种长链非编码RNA,其可作为主要的调节因子，参与细胞的生命过程。在胃癌细胞系中下调lncRNA p21可调控YAP mRNA及蛋白表达量升高，抑制胃癌细胞凋亡[27]。下调甲状腺细胞系中的linc00958表达可抑制其增殖、迁移和侵袭能力。lncRNA的异常表达也能导致肿瘤耐药。既往研究证实，lncHOTAIR可以增加H3K27me3的表达，从而抑制DR5的转录，抑制胰腺癌细胞的凋亡，促进其耐药[28]。lncMALAT1在原发性非小细胞肺癌中过度表达，在体外细胞实验中发现，其可通过分泌miR-200a调节人肺腺癌A549细胞中ZEB1的表达，从而促进肺癌细胞的增殖和吉非替尼的耐药[29]。PCGEM1的表达可通过抑制PARP裂解和延迟肿瘤抑制因子p53和p21的诱导，抑制阿霉素诱导的细胞凋亡。在体外实验中发现，下调PCGEM1可通过结合miR-129-5p及抑制ETV1,降低Hep3B/OXA细胞对奥沙利铂的耐药性[30,31]。过表达肠癌细胞系L-OHP中的lncRNA OR3A4,可以提高铂类的耐药性[32]。以上研究都指出，lncRNA通过各种机制参加肿瘤的发生进展。

本研究显示，lncRNA POLG-DT在新辅助化疗耐药非小细胞肺癌患者组织中表达增加，通过体外实验进一步验证其可调控非小细胞肺癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，进一步研究提示POLG-DG促进肿瘤细胞的有丝分裂，通过促进细胞进入S期，促进肿瘤的发生发展，促进非小细胞肺癌患者的新辅助化疗耐药。POLG-DT参与肿瘤耐药的机制有待进一步研究。

参考文献:

[1]中华人民共和国国家卫生健委员会.原发性肺癌诊疗指南(2022年版)[J].中国合理用药探索,2022. 19(9):

[27]陈莹,江雪,倪彭智,等长链基因间非编码RNA-p21通过调控YAP表达促进胃癌细胞凋亡[J]现代肿瘤医学,2023,31(10):

[32]李祎龙,郭亚娟,杨洁,等.长链非编码RNA OR3A4促进结直肠癌细胞奥沙利铂耐药[J]现代肿瘤医学,2021,29(15):

基金资助:广东省广州市科技局基础研究计划项目(编号:2060206);

文章来源:吴永晖,吴文杰,傅文凡等.lncRNA POLG-DT在非小细胞肺癌新辅助化疗耐药患者组织中高表达并促进癌细胞增殖､迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2023,31(16):2983-2988.