肺癌死亡率位居全世界恶性肿瘤死亡原因的首位，近50年来，全世界范围内肺癌的发病率明显上升[1]。化疗在肺癌的临床治疗中起着至关重要的作用。然而，临床上正在使用的化疗药物大多是广谱的细胞毒类药物，患者耐受 差，疗效个体差异大。新兴的靶向药物虽降低了毒副反应，但其种类少，仍不能满足临床需要。由于肿瘤是一个异质性、多态性、分化不均的细胞群体，其发生发展是一个多基因异常累积的过程，这决定了肿瘤对同一种药物敏感性的巨大差异及耐药性的普遍存在，致使化疗效果不够理想[2]。因此临床亟需要能够针对某一个体的个性化精准治疗技术的突破。

目前利用基因测序技术寻找特定致癌靶点，选择有针对性的化疗或靶向药物对肿瘤细胞精准打击成为肿瘤治疗的新模式和热点[3]。然而仅靠基因检测在大多数情况下不能提供最合理而有效的用药方案。为了避免肿瘤药物使用的盲目性，提高药物的有效率，利用患者自体原代肿瘤细胞体外进行候选药物或药物组合精确的药物敏感性测试，成为一种更直接、更准确的肿瘤诊治模式。

大量国内外临床研究[4,5]表明肿瘤体外药敏检测与临床疗效存在一定的相关性，并以此预测肿瘤患者化疗效果，为临床个体化治疗提供了更多的选择。

1、常见肿瘤体外药敏实验方法

精准治疗时代，肿瘤体外药敏检测是个性化治疗的重要研究方向。自从上个世纪50年代开始，肿瘤药敏总体呈现简单、快速、准确和可靠的发展趋势。到目前为止，肿瘤体外药敏检测在国内外广泛应用于临床上(详细如下图1时间轴所示)。

现将目前具有代表性的几种体外药敏实验及其存在的优缺点介绍如下，并着重介绍热门体外药敏实验方法在肺恶性肿瘤治疗中的最新研究进展。

图1肿瘤药敏发展时间轴  

1.1四甲基偶氮唑盐比色法(methylthiazolyl tetrazolium assay, MTT)

MTT可还原为不可溶的紫蓝色结晶甲瓒，甲瓒可溶解于盐酸异丙醇或二甲基亚砜，呈蓝色溶液，通过酶标仪测定待测溶液的吸光度计算药物对肿瘤细胞的敏感性。由于MTT比色法简单、快速、灵敏，可以在短时间内进行大量标本测定，成为较为常用的传统体外药敏实验方法之一[6]。

1.2生物荧光体外药敏检测法(ATP-based tumor chemosensitivity assay, ATP-TCA)

ATP在细胞凋亡后因机体自然代谢会迅速水解，而活细胞的ATP含量基本恒定，在体外使用原代细胞培养并测量暴露于药物的细胞内ATP的含量，可反应活细胞的数量从而间接反应细胞增殖活性。ATP-TCA具有灵敏度高、特异性高、重现性好、对肿瘤细胞数要求更低等优点[7,8]。

1.3胶滴肿瘤药敏检测技术(collagen droplet embedded drugsensitivity test, CD-DST)

该方法是从肿瘤患者体内提取肿瘤组织，通过酶消化细胞外基质，收集肿瘤细胞成分，然后将肿瘤细胞包埋于胶原凝胶滴中进行立体培养，使其在接近人体生理状态的环境中对抗癌药物的敏感性进行定量分析。其主要优势是除去了培养体系中成纤维细胞污染引起的掩蔽效应[9],但该方法存在操作繁琐以及需要成像分析仪等缺点，在国内应用相对较少。

1.4立体组织培养药物测定实验(histoculture drug response assay, HDRA)

HDRA是将肿瘤组织块在三维立体空间结构的载体中进行培养的传统体外药敏检测法。实验将培养的组织块加入化疗药物作用一定时间后，观察化疗药物对其抑制作用。HDRA法能更优的模拟体内环境。HDRA在3天内出具检测结果，其成功率超过90%[10,11]。但该方法实验要求较高、结果也常因组织取材不同而有差异。

1.5类器官(organoids)

肿瘤类器官(patient-derived organoids, PDO)[12]是通过对肿瘤组织进行三维培养得到的保留原始肿瘤多项特征的多细胞团。PDO培养成功率较高，约为50%～80%[13]。成功培养的PDO在组织结构、基因组、转录组以及功能上都与原始肿瘤组织高度相似[14]。类器官的培养是将肿瘤细胞包埋在含有细胞外基质的Matrigel中，并通过添加含Wnt、R-spondin1、EGF和Noggin等[13]生长因子的培养基来完成，最终形成的三维多细胞团可以在96孔板或384孔板上进行药敏检测。已有研究表明[15],PDO的药敏结果可以用于临床指导肿瘤患者个体化治疗的药物选择。

1.6微流控芯片技术(microfluidics)

以微流控系统作为药物筛选平台[16],是将细胞培养、药物浓度梯度、不同细胞或组织相互作用等多个单元集合在一个装置上进行药物敏感性分析。该系统[16,17]能够实时监测整个分析过程，装置微型化和集成化，可实现高灵敏的快速检测和高通量的药物筛选。近年来，微流控芯片的应用在癌症治疗领域显示出巨大的应用前景。其微通道中流体层流流动的方式能通过控制细胞培养相关参数更好地模拟体内微环境。此外，微流控芯片的单元结构与细胞大小相仿，且芯片最常使用的材料如聚二甲基硅氧烷，无毒性，具有良好的生物相容性、光学性能和透气性，适宜细胞研究。

1.7患者来源的肿瘤细胞群(patient-derived tumor-like cell clusters, PTC)

PTC是一种基于患者来源的原代肿瘤细胞体外培养方法建立的三维(3-dimensional, 3D)肿瘤体外药敏检测模型[18]。PTC由原代上皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞的自组装和增殖产生，这些细胞在一定程度上重现了原始肿瘤的结构和功能，并通过改良培养基和培养微环境，优化了微肿瘤培养条件。PTC的整体培养成功率为89.9%,预测其临床结果的总体准确率为93%。

1.8高通量药敏检测技术(high-throughput drug sensitivity, HDS)

HDS是一种基于改良型细胞条件重编程技术的新型可再生原代癌细胞药敏检测技术。该技术的核心是利用高通量药物筛选的方法对肿瘤患者体内提取出来的原代癌细胞进行体外培养和高通量药物敏感性检测。高通量的一大优点就是检测的药物数量多，所筛选的药物包括FDA批准临床使用的药物以及已进入临床试验阶段的药物。此外，该技术实现了在短期内大量扩增富集保持患者体内癌细胞基因特性和药敏特性的原代癌细胞，可为肿瘤患者最大限度地筛选出可用的药物[19]。

1.9类器官芯片(organoids-on-chips)

类器官自我组装的过程遵循体内器官发育程序，但其培养体系不可控制且缺乏微环境的相互作用[20]。因此，需要开发能够精确产生、调控和分析类器官及其微环境的工具[21]。器官芯片是在微流控装置中培养人体器官的微型模型，主要优势是能够精确控制细胞及微环境[21]。类器官芯片是将器官芯片和类器官技术相整合构建的器官生理微系统，通过优势互补，既能模拟器官的生理结构和功能特征，又能克服类器官培养过程中分子信号不可自动化精确调控的局限。类器官芯片一个最重要的应用是药物筛选，AU等人[22]研制了一种基于微流控技术的肝类器官药物筛选平台，它可以控制单个细胞凝胶团的运动，从而达到对单个类器官的检测效果，这样既能节省类器官使用数量，又可以提高实验通量。

现有体外肿瘤药敏实验技术的优缺点详见表1。

表1现有体外肿瘤药敏实验技术的优缺点

2、肿瘤体外药敏实验在肺恶性肿瘤治疗中的研究进展

下面主要介绍当前热门的基于类器官、HDS、微流控芯片、PTC及类器官芯片的肿瘤体外药敏检测技术近几年来在肺恶性肿瘤临床中的应用进展。

2.1肺癌类器官的临床应用

越来越多的证据表明，类器官可以作为评估患者对抗癌药物的特异性反应的模型工具。2019年KIM等人[14]首次报道了队列性的肺癌类器官(lung cancer organoids, LCOs)的培养、鉴定、药物筛选，已开发出具有两种基因突变的LCOs来分析对奥拉帕尼的反应。使用该系统，具有BRCA2p.W2619C突变的类器官的奥拉帕尼半数最大抑制浓度(the half-maximal inhibitory concentration, IC50)低于具有BRCA2 p.M965I突变的类器官。奥拉帕尼可破坏具有BRCA2p.W2619C突变的肺癌类器官的结构，且给予奥拉帕尼治疗也抑制了来自该类器官的肿瘤异种移植模型体内的肿瘤的生长。WANG等人[23]成功构建了一例来自42岁女性患者的类器官，该患者为HER-2-A775_G776YVMA插入突变的晚期肺腺癌。在给予抗HER-2药物(阿法替尼、T-DM1和吡罗替尼)后，作者发现吡罗替尼在使用临床相关浓度的体外和体内抑制肿瘤生长方面最有效。在15例HER-2突变非小细胞肺癌患者中进行的吡罗替尼(400毫克，口服，每日一次)的Ⅱ期临床研究结果证实，给予吡罗替尼组的客观缓解率为53.3%,中位无进展生存时间为6.4个月。这一研究结果说明利用肿瘤类器官的药物筛选系统可能被用于体外优选个体患者的用药方案。2020年，北京协和医院梁乃新教授及其团队[24]报道通过类器官药敏分析为1例早期肺癌术后复发、EGFR+TP53合并突变患者提供临床用药决策的实验证据，患者获得了长达9个月的无进展生存期。目前，类器官的临床观察性试验已取得不错的结果[25,26],但其大多是基于胃肠肿瘤类器官，针对LCOs药物敏感性的临床转化研究仍处于初级阶段。目前，欧洲有两项肺癌PDO的临床试验[27]正在进行，入组对象均为Ⅳ期肺癌，研究目的分别是探究PDO对肺癌标准 治疗的预测准确性和判 断PDO筛选出的末线治疗方案在临床上的有效性(clinical trials.gov: TUMOROID,NL49002.031.14;SENSOR,NL50400.031.14)。

类器官在药物筛选、肿瘤个性化治疗方面具有汇集原始肿瘤特征、可操作性强、增殖较快、稳定性较高、可高流量筛选等优点。然而，PDO的一个关键缺陷在于缺乏肿瘤微环境相关细胞参与。随着免疫治疗和抗血管治疗在肺癌治疗中地位的不断攀升，研究肿瘤细胞和肿瘤微环境的交互关系显得尤为重要，故需完善与基质细胞、血管干细胞、淋巴细胞等的类器官共培养体系。

2.2 HDS用于肺癌个性化治疗

高通量体外药敏实验是一种通过科学实验帮助找到“有效的药物”,从而制定“个体化用药方案”的检测项目。国外方面如美国哈佛大学[28]对获得性耐药的非小细胞肺癌患者进行了涵盖76种靶向药物的体外药敏检测实验，发现了针对耐药性非小细胞肺癌有效的新型药物组合。国内方面也有部分省市在开展相关实验，王丹[29]利用高通量体外药敏技术为晚期肺癌患者提供个性化治疗方案。LIU等人[30]利用小细胞肺癌细胞对1 092种FDA批准的化合物进行高通量药敏检测，通过组合高通量药物筛选，发现金诺芬能够协同增强顺铂在耐药小细胞肺癌细胞中的抗肿瘤活性，同时有协同增强诱导细胞周期阻滞和凋亡的效果，揭示金诺芬是小细胞肺癌顺铂药物的潜在致敏剂。刘飞扬等[19]利用改良型条件重编程技术开发了高通量药物敏感性检测体系，并在肺癌、肝癌、血液肿瘤等癌种上进行了临床研究，取得了良好效果。HDS可同时对上百种药物进行药物敏感性的筛查，故其在药敏检测上更为高效。目前相关研究正在国内平行开展多中心临床实验。

2.3 PTC指导临床用药

2021年中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology, CSCO)上，姜丽岩教授受邀做题为《微肿瘤PTC在非小细胞肺癌精准治疗中的应用和探索》的主题演讲，分享两个临床案例：一例男性低分化肺腺癌患者，临床采用含铂两药化疗方案，PTC药敏检测结果提示此方案临床可获益，用药后影像学评效疾病缓解；另一例是EGFR突变的肺癌患者，在临床用药前后的影像学检测结果显示吉非替尼无效，奥希替尼有效，此结果与PTC药敏检测结果一致。以上案例均表明PTC能够精准预测肺癌患者的临床用药疗效。但这些发现需要在更大规模的临床实验中得到验证。

2.4微流控芯片及类器官芯片在肺癌药敏分析中的开发应用

XU等人[31]报道了基于微流控芯片的3D共培养药物敏感性测试平台，来自新鲜肺癌组织的细胞在微流体装置内进行3D培养，经浓度梯度发生器自动产生不同化疗药物浓度，平行测定不同抗癌药物的敏感性，并优化单一药物和这些药物组合的剂量，他们同时为8例肺癌患者提供明确的个体化处方。研究结果表明，微流控芯片三维培养药敏检测平台有望应用于肺癌的个体化治疗。2019年JUNG等人[32]则开发了一站式肺癌类器官芯片，可直接在微生理系统上进行3D肺癌类器官培养和药物敏感性测试。该平台以大小可控的方式可重复地产生3D肺癌类器官，体现了类器官芯片的均一性优势。2021年，来自清华大学、北京航空航天大学、北大人民医院等单位[33]的联合团队开发出全新的集成超疏水微孔阵列芯片(InSMAR-chip),将其用于肺癌类器官的高通量三维培养和分析，仅在一周时间内获得药敏结果。实验证明这些药物测试结果与患者来源的异种移植瘤及临床结果高度吻合，较传统384孔板具有通量高、体积小、消耗低、快速等优点，并可进行实时的追踪。因此，将微流控芯片与肿瘤类器官两项前沿技术结合，已初步显示出了对肿瘤患者抗癌药物临床疗效预测的效率和时效。

3、展望

在临床选择治疗方案前进行药物敏感性实验，根据药敏检测结果选择最佳治疗方案，可显著提高治疗疗效，减少毒副反应。目前，肿瘤药物敏感性实验虽然取得了一定的成果，但由于各种实验方法都有其局限性，没有统一的标准操作规程，因此在临床还没有大规模地开展。传统体外药敏检测技术中ATP-TCA法、MTT法都是药敏检测实验中较为实用的方法，性价比较高，易于推广。但这些方法依旧各有不足，并且无法克服其共有的缺点，例如无法实现高通量、无法真正模拟体内环境等。而比较流行的基于类器官、微流控芯片、PTC、类器官芯片等肿瘤药敏检测方法及HDS技术在应用的广度和深度均有所扩展，更注重考虑药敏检测与患者体内反应的一致性。尽管当前肿瘤体外药敏实验技术领域已经取得迅猛发展，但由于类器官力学实验性与概念性研究的缺乏，该领域仍将面临着长期的挑战。在模拟稳态或疾病条件下可通过加强控制多个组织间的相互作用，以进一步支持体外药物敏感性技术在个性化与精确医学中的应用。而微流控芯片、类器官芯片及PTC技术均为跨入个体化医疗的新兴技术，技术尚无标准化，培养体系还不是很稳定，将来，细胞培养及鉴定流程的标准化、培养成功率的提高、药物敏感性相关参数的优化等仍然需要开展大量工作，尤其是大队列临床实验来进行进一步地探究与优化。HDS技术也因其检测费用昂贵至今未能普及推广应用于临床，目前临床开发阶段的药物开发失败率仍然较高，有望通过减少试剂的消耗、利用尖端技术开发新型高通量筛选技术设备降低成本。随着研究的不断深入和革新，体外药敏检测技术及临床前研究模型会逐渐趋于完善，使其检测结果与药物在人体内的临床实验结果逐步统一。

在众多癌症中，肺癌在遗传学相关研究及基于基因信息的临床精准医学研究更为深入。体外药敏检测模型及方法可以帮助人们更好地理解这些遗传信息的改变是如何影响肿瘤的发展与治疗的。本文侧重介绍了当前热门的类器官、微流控芯片、HDS、PTC技术及类器官芯片在肺癌治疗中的研究进展。总体而言，肿瘤体外药物敏感性实验具有重要的发展前景和应用价值，但仍需要大量的临床实验对各类方法进行优化完善。在精准医学领域，肿瘤体外药敏实验可以与基因测序相辅相成。相信在不久的将来，肿瘤体外药物敏感性实验会更多地应用于临床中，为肺癌患者个性化治疗带来新的希望。

参考文献:

[6]李恒善,云耀峰,梁润,等.应用MTT法对恶性肿瘤原代细胞培养进行规范化体外药敏试验的研究[J]中国实用医药,

[19]刘飞扬,黄瑞,任涛,等.肿瘤精准用药治疗的技术体系[J].高科技与产业化,2016,242(7):5

基金资助:安徽省卫生健康委员会科学研究项目(编号:AHWJ2021b087);

文章来源:王云,刘飞扬,张利伟.体外药物敏感性实验在肺癌治疗中的研究现状[J].现代肿瘤医学,2023,31(15):2926-2931.