化疗是目前多采用的肺癌治疗方式之一，铂类化疗药物是其重要的化疗药物，而多药耐药的产生严重影响治疗效果，因此，降低癌细胞的化疗耐药性对其治疗具有重要意义[1,2]。研究影响肺癌耐药的相关基因，通过调控耐药相关基因与化学疗法结合可以更好治疗肺癌[3]。环状RNA(circRNA)是一类具有环形结构的独特RNA分子，其在肿瘤中的异常表达不仅与肿瘤的恶性相关，同时可参与调控肿瘤进展，影响其化疗耐药性，为肿瘤的诊断与治疗提供了新思路[4]。研究报道circ重组人溶酶体相关膜蛋白(LAMP)1通过充当miR-615-5p的竞争性内源RNA(ceRNA)来调节盘状结构域受体家族成员(DDR)2的表达，从而促进T细胞淋巴母细胞淋巴瘤的进展[5]。circLAMP通过miR-556-5p和miR-567介导的阴阳因子(YY)1激活促进胆管癌的生长和转移[6]。然而circLAMP在肺癌中的作用及其对肺癌细胞及其顺铂(DDP)耐药的影响及机制尚不清楚。本实验通过StarBase预测发现circLAMP与miR-1193有结合位点。研究报道miR-1193过表达抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移[7]。环状RNA SEC24相关基因家族成员(circSEC24)A通过调节miR-1193/丝裂原活化蛋白激酶(MAP)3K9轴促进皮肤鳞状细胞癌的发展[8]。而miR-1193对肺癌细胞DDP耐药性的影响也尚不清楚。本实验主要探究了circLAMP对肺癌细胞DDP耐药性的影响，同时观察了circLAMP能否通过靶向miR-1193影响肺癌细胞DDP耐药性。

1、材料与方法

1.1主要材料

肺癌细胞株A549及肺癌DDP耐药细胞株A549/DDP,深圳市豪地华拓生物科技有限公司；RPMI1640培养基，武汉益普生物科技有限公司；DDP,中检所；噻唑蓝(MTT)试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CCK-8试剂盒、凋亡检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂，厦门慧嘉生物科技有限公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒，日本Takara;胎牛血清(FBS),浙江天杭；Transwell小室和基质胶，上海子起生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒，上海贝博生物；引物序列、miR-1193模拟物(mimics)和抑制剂(anti-miR-1193)、circLAMP1小干扰RNA(si-circLAMP1)、小干扰RNA阴性序列(si-NC)、模拟对照序列(miR-NC)和抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、野生型(WT)和突变型(MUT)circLAMP1荧光素酶载体，上海生工。

1.2细胞培养

将A549、A549/DDP细胞均接种在完全培养基(含10% FBS的RPMI1640培养基)中，置于5% CO2培养箱中培养。

1.3细胞转染与分组

未转染的A549和A549/DDP细胞用于检测IC50值，分别记为A549组和A549/DDP组。取对数期A549/DDP细胞，将si-circLAMP1、si-NC、miR-1193 mimics及miR-NC转染至A549/DDP细胞后，用2.5μg/ml的DDP处理48 h,记为DDP+si-circLAMP1组、DDP+si-NC组、DDP+miR-1193组、DDP+miR-NC组；将si-circLAMP1分别与anti-miR-1193或anti-miR-NC共转染至A549/DDP细胞后，用2.5μg/ml的DDP处理48 h,记为DDP+si-circLAMP1+anti-miR-1193组、DDP+si-circLAMP1+anti-miR-NC组。

1.4 MTT检测DDP对A549、A549/DDP细胞抑制率及半数抑制浓度(IC50)

将A549、A549/DDP细胞均接种至96孔板中，接种密度为2.5×104个/孔。培养4 h后，A549/DDP细胞分别用1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00μg/ml的DDP处理48 h作为实验组，以上浓度DDP处理的A549细胞作为对照组。然后加MTT(20μl/孔),孵育4 h。弃培养基，加二甲基亚砜(150μl/孔),振荡混匀。将96孔板置于酶标仪卡槽中，设置波长490 nm,检测光密度(OD)值。细胞抑制率(%)=(1-OD值实验组/OD值对照组)×100%。绘制细胞抑制率曲线，计算IC50。

1.5实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circLAMP1和miR-1193表达

利用Trizol试剂对各组细胞中总RNA进行提取，并反转录成cDNA,利用SYBR Premix ExTaqTM试剂盒进行PCR扩增，2-ΔΔCt法计算circLAMP1相对磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、miR-1193相对U6表达量。引物序列：circLAMP1上游：5′-CGTCCAGCTCATGAGTTTTGT-3′,下游：5′-AGACTGGGGTCAGAAGTGTTC-3′;GAPDH上游：5′-GGGAGC CAAAAGGGTCAT-3′,下游：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′;miR-1193上游：5′-GGGATGGTAGACCGGTGACGTGC-3′,下游：5′-C AGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′,下游：5′-GGAACGCTTC-ACGAATTTG-3′。

1.6 CCK-8检测细胞活性

按照上述1.3对各组细胞进行处理，然后加CCK-8(10μl/孔),孵育2 h。将96孔板置于酶标仪卡槽中，设置波长450 nm,测OD值。

1.7克隆形成实验检测细胞克隆形成数

按照上述1.3对各组细胞进行处理后，收集细胞制成单细胞悬液，接种于6孔板中(1.0×104个/孔),培养2 w,弃培养基。将细胞用甲醇固定、结晶紫染色后，显微镜下对大于50个细胞的集落进行计数。

1.8划痕实验检测细胞划痕愈合率

按照上述1.3对各组细胞进行处理后，收集细胞制成单细胞悬液，接种于24孔板内(5.0×104个/孔),培养4 h后，弃培养基，用200μl移液器枪头于底部划痕，并测量划痕间距离，记为d0 h。重新加完全培养基，培养24 h后，再次测量划痕间距，记为d24 h,计算划痕愈合率。划痕愈合率(%)=(d0 h-d24 h)/d0 h×100%。

1.9 Transwell检测侵袭细胞数

按照上述1.3对各组细胞进行处理后，收集细胞制成单细胞悬液。用基质胶包被Transwell小室的上室，然后于上室接种细胞(5.0×104个/室)。另取500μl培养液加至Transwell下室。培养24 h,弃培养基。将下室细胞用多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜下观察并计数。

1.10流式细胞术检测细胞凋亡

按照上述1.3对各组细胞进行处理后，收集细胞，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。然后利用膜联蛋白Ⅴ异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.11 Western印迹法检测蛋白表达

按照上述1.3对各组细胞进行处理后，收集细胞并提取细胞中总蛋白。对总蛋白浓度进行检测后，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验进行分离。将分离蛋白转膜和封闭处理后，置于4℃冰箱中分别用一抗孵育过夜。洗膜后，再于37℃摇床中用二抗孵育1 h。显影、成像，Image J软件分析各蛋白条带灰度值。

1.12双荧光素酶报告实验

将WT-circLAMP1与miR-NC或miR-1193 mimics、MUT-circLAMP1与miR-NC或miR-1193 mimics共转染至A549/DDP细胞中，收集转染后的各组细胞进行裂解。将裂解液离心(4 500 r/min、10 min),取20μl上清液，加100μl 1×萤火虫或海肾荧光素酶反应工作液，检测萤火虫和海肾的荧光强度。细胞荧光素酶活性以萤火虫与海肾荧光强度的比值表示。

1.13统计学分析

采用SPSS20.0软件进行t检验。

2、结 果

2.1不同浓度DDP对肺癌A549细胞和肺癌DDP耐药细胞A549/DDP抑制率的影响

与A549组相比，A549/DDP组抑制率显著降低，IC50值显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 DDP对肺癌A549细胞和肺癌DDP耐药细胞A549/DDP抑制率的影响(x¯¯±s,n=9)

2.2 circLAMP1和miR-1193在肺癌DDP耐药细胞中的表达

A549/DDP细胞中circLAMP1表达显著高于A549细胞(3.29±0.27 vs 1.00±0.00,t=25.444,P<0.05),miR-1193表达水平显著低于A549细胞(0.35±0.03 vs 1.00±0.00,t=65.000,P<0.05)。

2.3干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞增殖的影响

与DDP+si-NC组比较，DDP+si-circLAMP1组A549/DDP细胞中circLAMP1表达水平降低，细胞活性降低，细胞克隆形成数减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

2.4干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞迁移侵袭的影响

与DDP+si-NC组比较，DDP+si-circLAMP1组A549/DDP细胞划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少，E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2、图3。

图1干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞克隆形成的影响(结晶紫染色)   

表2干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响(x¯¯±s,n=9)

图2干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞迁移、侵袭及凋亡相关蛋白表达的影响  

1～2:DDP+si-NC组，DDP+si-circLAMP1组

图3干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞 迁移、侵袭的影响(结晶紫染色)  

2.5干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞凋亡的影响

与DDP+si-NC组比较，DDP+si-circLAMP1组A549/DDP细胞凋亡率、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图2、图4、表3。

2.6 circLAMP1靶向调控miR-1193表达

StarBase预测发现circLAMP1的序列中含有与miR-1193互补的核苷酸序列，见图5。共转染WT-circLAMP1与miR-1193 mimics的A549/DDP细胞荧光素酶活性较共转染WT-circLAMP1与miR-NC的A549/DDP细胞显著降低(0.41±0.04 vs 0.98±0.07;t=21.210,P<0.05);共转染MUT-circLAMP1与miR-1193 mimics的A549/DDP细胞荧光素酶活性与共转染MUT-circLAMP1与miR-NC的A549/DDP细胞比较，差异无统计学意义(0.97±0.08 vs 1.00±0.06;t=0.900,P=0.381)。另转染si-circLAMP1的A549/DDP细胞中miR-1193表达水平较转染si-NC的A549/DDP细胞显著升高(2.99±0.21 vs 1.00±0.00;t=28.429,P<0.05)。

2.7 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

与DDP+miR-NC组比较，DDP+miR-1193组A549/DDP细胞中miR-1193表达水平升高，细胞活性降低，细胞克隆形成数减少，划痕愈合率降低，侵袭细胞数减少，凋亡率升高，E-cadherin、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达升高，N-cadherin蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6～9、表4、表5。

图4干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞凋亡率的影响 

表3干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞凋亡的影响(x¯¯±s,n=9)

图5 circLAMP1的序列中含有与miR-1193互补的核苷酸序列  

图6 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞 迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响  下载原图

图7 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞凋亡的影响  

图8 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞 克隆形成的影响(结晶紫染色)   

图9 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞 迁移、侵袭的影响(结晶紫染色)   

表4 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响(x¯¯±s,n=9)

表5 miR-1193过表达联合DDP对A549/DDP细胞迁移侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响

2.8下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用

与DDP+si-circLAMP1+anti-miR-NC组比较，DDP+si-circLAMP1+anti-miR-1193组A549/DDP细胞中miR-1193表达水平降低，细胞活性升高，细胞克隆形成数增加，划痕愈合率升高，侵袭细胞数增加，凋亡率降低，E-cadherin、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达降低，N-cadherin蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图10、表6、表7、图11～13。

图10下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达 联合DDP对A549/DDP细胞克隆形成的作用(结晶紫染色)   下载原图

表6下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用(x¯¯±s,n=9)

表7下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞相关蛋白表达的作用(x¯¯±s,n=9)

图11下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达 联合DDP对A549/DDP细胞凋亡的作用  

图12下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达 联合DDP对A549/DDP细胞迁移、侵袭的作用(结晶紫染色)  

图13下调miR-1193表达逆转了干扰circLAMP1表达联合DDP对A549/DDP细胞 相关蛋白表达的作用  

3、讨 论

DDP因其抗癌效果显著及广谱性等特点广泛应用于肺癌的临床治疗，但长期使用会产生耐药性。因此，研究肺癌DDP耐药性的分子机制，寻找可能的治疗干预靶点，可为临床治疗提供理论依据[9,10]。研究表明，多种circRNA影响肺癌细胞DDP耐药性[11]。如circ_0076305可通过海绵miR-296-5p调节非小细胞肺癌对DDP的耐药性[12]。敲除环状RNA TTP结合盒转运蛋白亚家族B成员10(circ-ABCB10)可通过miR-556-3p/腺苷酸激酶(AK)4轴促进肺癌细胞对DDP的敏感性[13]。敲除环状RNA蛋白质精氨酸甲基转移酶(circ-PRMT)5通过miR-4458/REV3L增强非小细胞肺癌细胞凋亡及对DDP敏感性[14]。而circLAMP对肺癌细胞DDP耐药性的影响尚不清楚。本实验结果说明，A549/DDP较A549更耐药，且A549/DDP细胞中circLAMP1表达水平高于A549细胞，提示circLAMP1可能与A549/DDP细胞DDP耐药性有关，本实验还表明，干扰circLAMP1表达联合DDP可抑制A549/DDP细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。

miRNA是介导DDP抵抗的有前途的候选者，研究miRNA及其上游调节剂circRNA与肺癌细胞DDP耐药性的关系，对于提高肺癌细胞对DDP的敏感性具有重要意义[15]。研究报道miR-1193过表达抑制人T细胞白血病细胞的增殖和侵袭[16]。LINC00963通过miR-1193/性别决定区域Y-框(SOX)4轴抑制皮肤鳞状细胞癌的增殖和迁移[17]。本实验结果表明，miR-1193过表达联合DDP可抑制A549/DDP细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。

综上所述，干扰circLAMP1表达可通过靶向调控miR-1193增强DDP对A549/DDP细胞增殖、迁移、侵袭的抑制和凋亡促进作用，可降低肺癌细胞的DDP耐药性。

参考文献:

[1]郁德杰,蔡永广.小细胞肺癌患者化疗耐药临床治疗的研究进展[J].抗感染药学,2018;15(3):375-8.

[2]张亚娟,常德,张健鹏.肺癌化疗中铂类耐药的研究进展[J].中国医学科学院学报,2017;39(1):150-5.

[4]陈天翔,杨运海.CircRNA在肺癌诊断与发生发展及耐药中的作用进展[J].中国肺癌杂志,2019;22(8):532-6.

文章来源:汤舒,陈永刚,邹吉利.circLAMP1靶向miR-1193调控肺癌细胞顺铂耐药性及机制[J].中国老年学杂志,2023,43(23):5851-5857.