目前，肺癌的发病率和死亡率仍居高不下，严重危及人类生命健康。根据2020年全球癌症数据统计显示，肺癌的发病率位列第二，死亡率位列第一[1]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKI)已被广泛应用于EGFR突变型晚期非小细胞肺癌患者的分子靶向治疗，如一代EGFR-TKI吉非替尼是临床上肺腺癌患者常选择的靶向治疗药物，然而患者接受靶向治疗9～14个月后常出现耐药现象[2,3]。目前已知EGFR-TKI获得性耐药机制有T790M突变、c-Met扩增或突变、PTEN下调、细胞类型转化和发生上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等[4]。但仍有部分耐药的机制未阐明。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是核苷酸数量大于200个的非编码RNA,无蛋白质编码功能，可以通过与蛋白质、RNA和DNA相互作用来调节基因表达。近期研究显示，lncRNA与恶性肿瘤的发生发展显著相关[5,6]。SHI等[7]发现lncRNA DILA1抑制细胞周期蛋白D1降解并有助于乳腺癌对他莫昔芬耐药性。最近研究发现的肺癌相关转录本1(lung cancer-related transcript 1,LUCAT1)是一种位于5号染色体q14.3区域的反义链的新型的长链非编码RNA,研究表明LUCAT1可促进非小细胞肺癌对铂类耐药[8]。

自噬可由饥饿、缺氧、放化疗和靶向药物等因素诱导，研究证明自噬可能是肿瘤细胞在放化疗、靶向治疗的应激不利环境下对肿瘤细胞起保护作用，导致肿瘤耐药的发生继而出现进展、转移[9,10,11,12]。我们前期研究发现无血清悬浮培养的A549干样细胞中LUCAT1高表达，下调LUCAT1可以抑制A549干样细胞的干性及自噬，另外敲低自噬关键基因Beclin1部分恢复了A549/GR细胞对吉非替尼的敏感性，因此我们猜测在肺腺癌A549干细胞LUCAT1和自噬可能存在密切的关系，其可能与肺腺癌对吉非替尼敏感性有关[13,14]。本研究中通过qRT-PCR、Western Blot发现肺腺癌PC-9/GR细胞高表达LUCAT1及自噬关键基因，由此猜想，LUCAT1可能通过与自噬相互作用参与肺腺癌细胞的吉非替尼耐药。因此，本研究旨在探索LUCAT1与自噬的关系及其在肺腺癌细胞对吉非替尼耐药的作用及潜在机制。

1、材料与方法

1.1 细胞

人肺腺癌吉非替尼获得性耐药细胞株PC-9/GR及其亲本细胞PC-9购自北纳生物(BNCC),吉非替尼耐药细胞株是由亲本细胞株逐渐低浓度的吉非 替尼加药培养后筛选出来的，历 时约6～8个月，目前PC-9/GR耐药指数为13.50。本研究PC-9/GR细胞进行实验前需在含1 μmol/L吉非替尼的完全培养基中培养48 h后进行实验。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司、0.25%的胰酶(含EDTA)购自美国HyClone公司。吉非替尼购自美国MedChemexpress生物科技公司。T25细胞培养瓶、离心管、Transwell板均购自美国Corning公司。兔抗人β-actin、Beclin1、p62多克隆抗体和二抗山羊抗兔均购自美国Proteintech公司。兔抗人LC3B多克隆抗体购自英国Abcam公司。逆转录试剂盒购自日本Takara公司。ECL化学发光底物购于上海七海复泰生物公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自以色列Biological Industries公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司。实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)试剂盒、DMSO、结晶紫、全蛋白提取试剂盒、快速封闭液、PVDF膜均购自北京索莱宝公司。4%的多聚甲醛购自合肥Biosharp公司。倒置相差显微镜、实时荧光定量PCR仪及激光共聚焦显微镜由遵义医科大学第三附属医院中心实验室提供，透射电子显微镜由遵义医科大学电镜室提供。

1.3 细胞培养及转染

在37 ℃、5%CO2、95%相对湿度条件下，人肺腺癌吉非替尼获得性耐药细胞PC-9/GR及亲本细胞株PC-9在含10%的胎牛血清、1%青-链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM高糖的完全培养基中培养，PC-9/GR细胞需加入0.1 μmol/L的吉非替尼维持，在显微镜下观察细胞生长状况，根据细胞状态及T25培养瓶中细胞密度和培养液的颜色来确定换液时间，通常1～2天需更换培养基，更换时先用37 ℃水浴锅预热过的PBS 5～6 mL清洗两遍细胞，完全吸尽PBS后，再加入预热配制好的培养基4～6 mL,移至孵箱培养，普通显微镜下观察细胞生长密度达到80%～90%时方可进行细胞传代或者冻存。干扰RNA shLUCAT1(Top strand: GATCCGCCTTGCTCAGTGTCACACATTTCATTCAAGAGATGAAATGTGTGACACTGAGCAAGGCTTTTTTG;Bottom strand: AATTCAAAAAAGCCTTGCTCAGTGTCACACATTTCATCTCTTGAATGAAATGTGTGACACTGAGCAAGGCG)、siRNA(GCCTTGCTCAGTGTCACACATTTCA)由上海汉恒生物有限公司合成，取对数生长期的PC-9/GR,参照LipofectamineTM 3000说明书转染lncRNA LUCAT1及其阴性对照组，转染结束后24 h更换细胞培养液。

1.4 CCK-8检测细胞活力和增殖能力

胰酶消化收集处于对数生长期的细胞制成单个细胞悬液，将5×104个/mL细胞悬液按吉非替尼浓度梯度：0、0.1、0.5、1、5、10、50、100 μmol/L接种至96孔板中，移至37 ℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后，加10 μL的 CCK-8试剂，孵育1.5 h, 酶标仪450 nm处测细胞光密度(optical density, OD)值，计算IC50(耐药指数=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50)。

1.5 克隆形成实验

收集处在对数生长期及状态良好的细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，按500个/孔的细胞数种3个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱培养，14天肉眼看到明显细胞团，冰PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min, PBS清洗后用吉姆萨染液染色30 min, PBS清洗干净，待水分吹干拍照并计数。

1.6 Transwell迁移实验

提前一天将细胞更换无血清培养基培养，第二天将细胞消化重悬成单个细胞、计数细胞，将100 μL的5×104个/mL细胞悬液接种至小室中，将小室移至加含20%胎牛血清的细胞培养基500 μL Transwell板孔中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h, 用冰PBS将小室清洗，800 μL多聚甲醛室温下固定30 min后清洗，800 μL 0.1%结晶紫染液锡箔纸避光室温染色30 min, 将小室用冰PBS洗干净，棉签轻轻擦上室表面未固定的细胞，镊子轻轻揭掉下膜，把膜的底面朝上自然晾干，放至载玻片上用显微镜观察。

1.7 qRT-PCR检测核酸表达

Trizol法提取细胞中总RNA,根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA,再按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行扩增，每个细胞样本实验重复3次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，lncRNA LUCAT1引物：F:5'-ACCATGTGTCAAGCTCGGATTGC-3', R: 5'-TGTGGTCTCTGGTGCCAAGGTC-3';β-actin引物：F:5'-GTTGCGTTACACCCTTTCTT-3',R:5'-ACCTTCACCGTTCCAGTTTT-3'。

1.8 Western Blot检测自噬蛋白表达

根据总蛋白提取试剂盒说明书提取细胞蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，制备蛋白样品，上样，进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶70 V、45 min, 分离胶110 V、120 min, 电泳完成后制作“三明治”转膜到PVDF膜上，转膜结束后快速封闭液室温摇床上封闭50 min, TBST洗膜，将 膜转至装有一抗的孵育 盒，4 ℃冰箱孵育过夜，第2天TBST洗膜，室温摇床上孵育二抗1 h, 再次洗涤，按照ECL化学发光试剂盒操作，通过凝胶成像仪自动曝光记录成像。

1.9 透射电子显微镜观察细胞自噬小体实验

收集处在对数生长期的细胞，4%多聚甲醛与戊二醛固定液前固定细胞团，漂洗，1%锇酸后固定，梯度脱水、浸透、包埋、聚合，半薄切片定位，超薄切片；铀、铅双重电子染色；透射电镜下观察细胞自噬小体。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2进行统计学分析实验数据及绘图，本实验数据均为计量资料，采用Shapiro-Wilk方法进行正态分布检验，符合正态分布的数据，采用均数±标准差(x¯±s)进行分析，2个不同变量差异比较采用双因素方差分析，方法使用独立样本t检验比较两组数据。采用单因素方差分析(One way ANOVA)对组间差异比较结果进行检验。P值<0.05(双侧)表示差异或影响因素具有统计学意义。每组实验均重复3次。

2、结果

2.1 耐药细胞PC-9/GR具有较强耐药性和增殖能力

CCK-8实验检测PC-9、PC-9/GR细胞对吉非替尼药物敏感性及增殖能力的差异性，结果显示：随着吉非替尼 浓度增加细胞存活率下降，计算 细胞的IC50值[PC-9/GR:(3.15±0.79)μmol/L vs PC-9:(0.23±0.11)μmol/L],PC-9/GR耐药指数为13.50,PC-9/GR较PC-9细胞具有较强的增殖能力，差异具有统计学意义(P<0.05,图1)。实验结果表明耐药细胞对吉非替尼具有较强的耐药性及具有较强的增殖能力

2.2 耐药细胞PC-9/GR具有较强的克隆形成和迁移能力

我们已发现耐药细胞具有较强增殖能力，为进一步鉴定PC-9/GR的耐药性，通过克隆形成、Transwell迁移实验检测细胞的功能。克隆形成实验结果：PC-9/GR细胞克隆形成能力[(18.44±3.15)个/平皿)]较PC-9细胞[(12.64± 0.99)个/平皿]明显增强(P<0.05,图2A-B)。Transwell迁移实验结果：PC-9/GR细胞[(574.70±66.83)个/视野]较PC-9细胞[(423.30±40.5)个/视野]具有较强的迁移能力(P<0.05,图2C-D)。实验结果表明耐药细胞具有较强的克隆形成能力及迁移能力。

2.3 PC-9/GR细胞较亲本细胞高表达lncRNA LUCAT1

我们已通过CCK-8、克隆形成及迁移实验证明PC-9/GR具有对吉非替尼较稳定的靶向耐药，现为探索lncRNA LUCAT1是否与肺腺癌吉非替尼耐药相关，通过qRT-PCR法检测PC-9、PC-9/GR细胞中lncRNA LUCAT1的表达情况，实验结果显示PC-9/GR细胞(5.92±0.56)较PC-9细胞(1.03±0.28)高表达LUCAT1,具 有明显的差异 性(P<0.05,图3)。结果提示lncRNA LUCAT1可能参与肺腺癌对吉非替尼耐药的发生。

2.4 PC-9/GR细胞具有较高自噬水平

为了验证自噬是否参与肺腺癌细胞对吉非替尼的靶向耐药发生，为证实耐药细胞株中自噬被激活，通过透射电子显微镜观察细胞自噬泡的数量，结果显示：PC-9/GR细胞中自噬体数量[(8.80±3.27)个/视野]较PC-9细胞[(4.6±1.14)个/视野]明显增多，差异具有统计学意义(P<0.05,图4A)。Western Blot实验结果显示：PC-9/GR细胞中LC3-I向LC3-II转化较亲本细胞增加、p62蛋白表达量较亲本细胞降低(P<0.05),而Beclin1蛋白在PC-9、PC-9/GR细胞中表达无明显差异性(P>0.05)(图4B-C)。结果表明肺腺癌细胞PC-9/GR具有较高水平自噬现象。

2.5 lncRNA LUCAT1慢病毒转染构建稳定细胞株

慢病毒感染细胞，敲低耐药细胞中lncRNA LUCAT1基因，通过qRT-PCR法检测细胞内LUCAT1表达，确定有效地调控了细胞 内LUCAT1的表达(PC-9/GR-shLUCAT1:0.51±0.10 vs PC-9/GR-NC:1.00±0.09)(P<0.05,图5)。

2.6 敲低LUCAT1后对耐药细胞PC-9/GR生物学功能的影响

为进一步验证lncRNA LUCAT1在肺腺癌PC-9/GR细胞对吉非替尼耐药性中的作用，CCK-8、克隆形成及迁移实验检测敲低LUCAT1后细胞的耐药性、克隆形成能力及迁移能力，结果发现PC-9/GR-shLUCAT1细胞的IC50[(1.79±0.30)μmol/L]较PC-9/GR-NC细胞[(2.84±0.18)μmol/L]明显下降(P<0.05,图6A-B),PC-9/GR-shLUCAT1细胞克隆形成数[(49.00±1.00)个/平皿]较PC-9/GR-NC细胞[(72.67±4.19)个/平皿]明显减少(P<0.05,图6C-D);同时PC-9/GR-shLUCAT1细胞迁移数[(318.70±20.21)个/视野]较PC-9/GR-NC细胞[(689.00±69.09)个/视野]明显减少(P<0.05,图6E-F)。结果表明敲低LUCAT1可以增强PC-9/GR细胞对吉非替尼的敏感性，并抑制细胞的增殖与迁移。

2.7 LUCAT1抑制PC-9/GR细胞中自噬发生

Western Blot检测调控LUCAT1后对细胞自噬关键基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达情况。实验结果发现PC-9/GR-shLUCAT1与对照细胞PC-9/GR-NC相比，自噬关键蛋白LC3-II/LC3-I明显下降、自噬相关蛋白p62表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05),而敲低LUCAT1后细胞中自噬关键蛋白Beclin1无明显变化(图7)。结果表明敲低LUCAT1可以抑制PC-9/GR细胞自噬。

3、讨论

近些年来，尽管一些研究发现在非小细胞肺癌化疗及靶向耐药中，长链非编码RNAs与自噬之间存在着密切关系，但具体的作用及机制尚未完全阐明[15,16,17]。结合我们团队前期研究基础，本研究首先通过CCK-8、克隆形成、Transwell迁移等相关实验验证了PC-9/GR对吉非替尼具有较稳定的靶向耐药性，为我们下一步实验研究奠定了理想的细胞模型。在 其耐药的基础上我们通 过qRT-PCR法检测发现lncRNA LUCAT1明显的高于亲本细胞，我们研究团队既往研究发现LUCAT1也在A549干细胞中高表达，而肿瘤干细胞的干性也包括肿瘤的耐药性，因此这与本实验研究结果相吻合。

回顾目前一些相关研究进展，HAN等[18]研究发 现lncRNA LUCAT1高表达并参与骨肉瘤细胞对甲氨蝶呤耐药的产生，这从侧面上也验证及支持我们的实验结果。自噬是一个复杂且高度保守过程，研究发现抗肿瘤药物包括化疗及靶向药物可以激活非小细胞肺癌或其他一些肿瘤细胞产生保护性自噬而导致肿瘤细胞的耐药性。因此本研究通过透射电子显微镜发现耐药细胞PC-9/GR较亲本细胞自噬小体明显增多，Western Blot实验验证了耐药细胞中自噬关键基因LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白高表达、p62蛋白低表达，但Beclin1蛋白在PC-9/GR和PC-9细胞中表达无明显差异，但总的而言以上实验结果提示耐药细胞株PC-9/GR存在高水平的自噬。结合以上研究结果发现lncRNA LUCAT1、自噬与肺腺癌PC-9/GR细胞对吉非替尼的耐药性有着密切的关系，但具体的作用机制尚不明确，为了探 索lncRNA LUCAT1与自噬之间关系在肺腺癌吉非替尼耐药细胞株中的作用及机制，首先通过RNA干扰技术敲低耐药细胞株PC-9/GR中lncRNA LUCAT1,qRT-PCR法验证PC-9/GR-shLUCAT1细胞株构建成功后，通过CCK-8、克隆形成及Transwell迁 移等相关实验检测细胞的耐药性，结果表 明PC-9/GR-shLUCAT1细胞的IC50、克隆形成能力及迁移能力明显下降，说明lncRNA LUCAT1对吉非替尼肺腺癌耐药细胞的耐药性具有调控作用。Western Blot实验结果显示在PC-9/GR细胞中敲低LUCAT1后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白下降、p62蛋白升高，但在PC-9及PC-9/GR细胞中Beclin1蛋白则不受LUCAT1的调控影响。回顾目前自噬相关分子机制的研究基础，自噬关键基因LC3贯穿自噬小体形成的开始、延伸及结束的整个过程，其通过与p62相互作用识别泛素化蛋白从而在细胞代谢产物的选择、靶向和降解中不可或缺[19,20]。因此，结合本研究实验结果，我们初步发现在肺腺癌吉非替尼获得性耐药细胞PC-9/GR中LC3B/p62通路介导的自噬可能是LUCAT1调控的主要机制。

综上所述，本研究显示肺腺癌吉非替尼获得性耐药细胞株PC-9/GR对吉非替尼具有较稳定的靶向耐药性，并高表达lncRNA LUCAT1及 具有较高的自噬水平现 象，发现LUCAT1可能通过LC3B/p62介导的自噬正向调控自噬促进肺腺癌细胞对吉非替尼的靶向耐药性，研究结果为阐明肺腺癌靶向耐药可能机制提供新的方向，从而为寻找肺腺癌靶向治疗新的靶点及提高肺癌治疗的疗效奠定一定的实验和理论基础。

参考文献:

[13]刘长路.LUCAT1/Beclin1调控肺腺癌A549干细胞干性的研究[D].遵义:遵义医科大学,2020.

[14]陈雨.自噬在EGFR野生型肺腺癌耐药细胞株A549/GR靶向耐药中的作用研究[D].遵义:遵义医科大学,2022.

基金资助:国家自然科学基金(编号:82060544);贵州省科技计划项目(编号:黔科合基础-ZK[2023]一般486);遵义市第一人民医院研究与试验发展课题(编号:院科字(2020)10号);

文章来源:姜梅,王鑫,李雷等.lncRNA LUCAT1影响自噬促进肺腺癌PC-9/GR细胞对吉非替尼耐药的研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(02):255-261.