肺癌是全世界发病率和死亡率最高的癌症之一，其5年生存率不到20%[1]。根据《2020年全球癌症统计》,全世界将有大约1 930万新发癌症病例和近1 000万死亡病例。其中新发肺癌病例占总病例11.4%,预计死亡人数占癌症死亡总数的18%[2]。尽管肺癌在外科手术、放射疗法和化学疗法方面已取得了很大进展，但其生存的改善仍然是一项巨大挑战[3]。任何分子机制的阐明和有效生物标志物的发现都将为肺癌治疗提供更大的希望[4]。

表观遗传学是具有稳定遗传特性的遗传学的一个分支，被定义为基于DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、基因沉默、RNA修饰等的功能相关变化或基因表达改变[5]。根据Modomic数据库，迄今为止在编码RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)中总共鉴定出171种RNA修饰。在所有修饰中，N6-甲基腺苷(m6A)是真核细胞中最普遍、最丰富的RNA修饰[6,7]。尽管m6A的早期发现是在20世纪70年代初，但m6A修饰的确切功能和机制直到最近仍不清楚[8,9]。随着RNA免疫沉淀测序技术与高通量测序技术和液相色谱等检测技术的快速发展，已鉴定出m6A修饰位点具有典型的共有序列RRACH ([G>A]m6AC[U>A>C]),并且m6A富含在3' 非翻译区(3' UTR),mRNA中的近终止密码子或ncRNA中最后一个外显子附近[10,11]。越来越多的证据表明，m6A参与了RNA代 谢的各个方 面，包括mRNA的剪接、3' 末端加工、出核、翻译调控、mRNA衰变和ncRNA加工[12]。与DNA和组蛋白甲基化相似，m6A甲基化在哺乳动物细胞中也是动态且可逆的，并由相应的酶(“Writers”、 “Erasers”和“Readers”)催化。

1、参与m6A修饰的相关蛋白及功能

1.1 Writers

m6A甲基化是通过一个多组分的甲基转移酶复合物(MTC)催化的。该复合物由甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)、WT1 相关蛋白(WTAP)、RNA结合基序蛋白15(RBM15)和RNA结合基序蛋白15B(RBM15B)等组成[13,14,15,16,17]。其中METTL3是与甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合并催化甲基转移的唯一催化亚基[18],是MTC的最重要组成部分，在从酵母到人类的真核生物中都高度保守[13]。METTL14是MTC的另一个活性成分。METTL3和METTL14在核中共定位，并以1∶1的比例形成稳定的复合物[14]。但是，只有具有内部SAM结合结构域的METTL3能充当催化剂，该结构域催化SAM中的甲基转移至RNA的腺嘌呤碱基中，从而产生S-腺苷高半胱氨酸(SAH),而METTL14主要起到稳定MTC结构的作用。WTAP、RBM15、RBM15B并没有催化功能，WTAP主要通过将METTL3和METTL14募集到核中来促进m6A修饰[15]。而RBM15和RBM15B可以结合METTL3和WTAP并将这两个蛋白引导至特定的RNA位点以进行m6A修饰[16,17]。此外甲基转移酶样蛋白16(METTL16)是新发现的独立RNA甲基转移酶，在剪接调控中起着重要作用[19,20]。

1.2 Erasers

m6A甲基化可以通过RNA去甲基化酶(“Erasers”)去除。脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)属于α-酮戊二酸依赖性双加氧酶AlkB家族[21],是第一个显示出对非综合症人类肥胖有贡献的基因[22,23]。 2011年，FTO被鉴定为m6A去甲基化酶，它将RNA中的m6A氧化成N6-羟甲基腺苷和N6-甲酰腺苷[24],确立了m6A可逆性修饰的观点[25]。随后在2013年发现了第二个去甲基化酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶AlkB同源物5(ALKBH5)[26]。ALKBH5在没有检测到中间产物的情况下，直接取消了对腺苷的m6A修饰[26]。此外，在最近的研究中还发现了另一种m6A去甲基化酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶AlkB同源物3(ALKBH3)[27]。有趣的是，ALKBH3优先作用于tRNA中的m6A,而不是mRNA或rRNA[28]。

1.3 Readers

虽然m6A修饰是由“Writers”和“Erasers”动态调节的，但“Readers”优先识别m6A修饰位点，影响RNA的命运并赋予其独特的生物学功能。“Readers”主要包括YT521-B同源(YTH)结构域家族蛋白(YTHDF1～3)、含YTH结构域的蛋白质(YTHDC1～2)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs, 包括IGF2BP1～3)、异质核核糖核酸蛋白(HNRNP)家族成员(HNRNPC/G/A2B1)和真核翻译起始因子3(eIF3),调控RNA的加工、结构、核输出、翻译和降解。YTH结构域作为m6A结合模块，具有保守的α/β折叠结构，可以区分未修饰的和m6A的mRNAs[29,30]。YTHDF2是第一个被识别的m6A阅读器，它通过直接募集CCR4-NOT腺苷酸酶 复合物来加速m6A修饰的转录物 的降解[31]。YTHDF1选择性识别m6A并与起始因子eIF3相互作用以促进翻译起始和蛋白质合成[32]。YTHDF3的结合位点主要位于3' UTR[33]。YTHDF3与YTHDF1协同促进m6A RNAs的翻译，同时还通过与YTHDF2直接相互作用来加速mRNA的降解[12,34]。YTHDC1调控靶基因的转录和mRNA的选择性剪接[35]。HNRNPC调节mRNA结构，而HNRNPA2B1涉及miRNA前转录[36]。IGF2BPs增强mRNA的稳定性和储存[37]。

2、m6A甲基化在肿瘤中的作用

对m6A的研究仍是表观遗传学的新兴领域，多项研究表明，其可逆性进展可控制并决定细胞的生长和分化，从而调节包括昼夜节律、精子发生、代谢、对热休克的反应、T细胞稳态的控制以及干细胞增殖和分化[38,39,40]。当前，已发现m6A甲基化在癌症的发生和发展中具有多种生物学调控功能，并且m6A甲基化的表达失调与各种癌症密切相关。从实体肿瘤到血液系统恶性肿瘤，大多数异常的m6A调节在促进肿瘤发生中起作用。首先，它们通过抑制抗癌基因的表达或增强癌基因的表达来促进癌干细胞的增殖、转移和侵袭而发挥其致癌作用，例如，METTL3可促进胶质瘤干细胞(GSCs)的干性[41,42]。GSCs的过度增殖可刺激肿瘤生长和侵袭，是 导致放化疗耐受的主要 原因[42]。低氧引起的ALKBH5上调，降低NANOG mRNA m6A甲基化，促进其表达，最终导致乳腺癌干细胞(BCSCs)能力增强[43]。然而，m6A在癌症中的作用不限于促进肿瘤发生。它更像一把双刃剑，有时也起到抑癌作用，例如，在70%的子宫内膜癌中，可以观察到由METTL14突变或METTL3表达降低导致的低m6A水平，而低m6A通过翻译抑制AKT负调控因子PHLPP2和AKT正调控因子mTORC264的mRNA稳定，与致癌AKT信号通路的激活增加相关[44]。同样，在透明细胞肾细胞癌中，低METTL3表达激活mTOR通路，并与较差的临床预后相关[45]。这些研究已证明m6A修饰在癌症的发展和进程中起着关键作用，并且许多相关的调节因子与患者的预后和临床结果相关。因此，这一领域的研究在确定新的癌症治疗靶标方面具有广阔的前景。

3、m6A甲基化在肺癌中的作用

3.1 诊断与预后

肺癌是具有高发病率和高死亡率的常见恶性肿瘤，引起了世界范围的广泛关注。大约80%的肺癌病例是非小细胞肺癌(NSCLC),其中包括肺腺癌(LUAD,50%～60%)和肺鳞状细胞癌(LUSC,30%)[46]。病理学特异性m6A调节因子的阐明将直接有助于肺癌的预测性、预防性和个性化医疗服务[4]。

LUAD是肺癌最常见的组织学表现，与m6A异常密切相关。许多研究表明，m6A调节因子无论是单独还是联合因子，在预测各种类型肺癌方面都具有预后价值[47,48,49,50]。在一项研究中，作者分析了TCGA数据库和GTEx数据库的347例正常组织样本和526例肿瘤样本的m6A甲基化调控因子的基因表达差异，并构建了诊断评分模型和预后风险模型，研究发现，m6A甲基化调节因子的表达在LUAD的进展中起重要作用，甚至被确定为有效的诊断和预后因素[51]。另一项研究也基于TCGA数据库对LUAD患者中m6A相关基因表达进行了全面分析，并通过共聚类分析、主成分分析(PCA)和Lasso回归研究了它们与预后的关系，成功建立了基于m6A的特征预测LUAD总体生存(OS)。多因素Cox分析显示，风险值可作为独立预后因素，提示m6A相关基因特征具有很大的预测价值。GEO的数据也验证了其有效性[52]。此外根据TCGA数据库分析，FTO下调与高的LUAD存活率显著相关，而免疫组化分析显示FTO表达水平与性别、肿瘤分期、肿瘤分化、浸润深度无关。研究表明FTO通过m6A去甲基化激活细胞迁移，从而促进LUAD的进展[53]。还有研究通过对TCGA、GEO等多个LUAD数据库进行样本比对分析发现，m6A 的“Readers” IGF2BP3 在 LUAD 组织中异常高表达，Cox回归分析显示，TNM分期和IGF2BP3表达是LUAD患者的独立预后因素。并结合生存曲线验证了IGF2BP3在LUAD中的预后价值。表明IGF2BP3可能是 LUAD 的致癌基因和潜在的预后生物标志物[54]。这 些研究表明m6A调节因子是很有前途的LUAD诊断及预 后标志物。

在LUSC中，研究首次使用GEO、TCGA和GDSC数据库资源鉴定了具有生物学和临床特征的免疫相关模型，根据与T滤泡辅助细胞相关的特征，LUSC患者分为两组，其风险评分水平不同。一般来说，低危患者的总体生存风险较高。在高、低危LUSC患者中m6A甲基化 调节因子的表达存在显著差 异，高危LUSC患者中ALKBH5、METTL3、HNRNPC和KIAA1429的比例明显降低。这些结果表明，低危LUSC患者预后不良的部分原因是m6A甲基化调控因子导致的，而m6A甲基化调控因子在LUSC中的异质性可能在作为预后指标和靶点中具有重要的临床意义[55]。但是，该机制尚不清楚，需要进一步研究。另一项研究通过对TCGA数据库的数据挖掘，首次确定了FTO作为LUSC的预后因子，功能缺失实验研究发现，FTO敲低在两个LUSC细胞系中 抑制细胞增殖和侵袭，同时促进细胞凋亡，FTO对细胞凋亡的调控是通过调节MZF1实现的，提示FTO在LUSC中具有肿瘤启动子功能。但LUSC中FTO升高的原 因值得进一步研究[56]。

3.2 耐药

肿瘤细胞对治疗药物产生耐药性是癌症治疗的主要障碍之一。通过改变m6A依赖通路介导的基因表达变化可导致化疗和放化疗敏感性的改变，从而影响治疗方案。对于晚期肺癌，化疗是治疗的有效手段之一，但获得性耐药大大降低了肺癌患者的远期生存。阐明m6A在肿瘤耐药中的作用具有重要意义，并可能为未来临床癌症治疗和药物开发提供线索。最近，已经证实了异常的表观遗传标记，对获得耐药性至关重要[57]。耐药性的发生是一个复杂的问题，涉及多种相互作用和调控[58,59]。干预RNA m6A甲基化可能是克服耐药的治疗策略。

阿法替尼是治疗非小细胞肺癌的一线抗癌药物。然而，耐药一直是影响其临床疗效的主要障碍。在阿法替尼耐药细胞系和敏感细胞系之间鉴定了11 506个m6A甲基化差异基因和3 494个差异表达基因，其中m6A甲基化差异基因与差异表达基因明显重叠。将m6A修饰水平与基因表达水平负相关的基因定义为m6A功能修饰基因，利用DAVID平台对这些基因进行功能富集分析。分析显示，m6A甲基化可能通过干扰细胞周期，影响药物反应，并影响NSCLC患者的预后。但还需在临床患者上验证[60]。

顺铂是一种抑制恶性细胞的铂类药物，广泛应用于NSCLC中[61]。耐药阻碍了NSCLC铂类化疗的应用[62]。研究发现肺癌组织中的METTL3 mRNA和蛋白水平高于正常的邻近肺组织，METTL3介导的更高水平的m6A修饰，使MALAT1的RNA水平增加。同时，METLT3/YTHDF3复合物增加了MALAT1的稳定性。此外，MALAT1充 当竞争性内源RNA,使miR-1914-3p发挥 作用，METTL3依赖于YTHDF1/3和eIF3B,通过调节MALAT1-miR-1914-3p-YAP轴，促进YAP相关蛋白mRNA翻译，提高YAP mRNA的稳定性，从而通过YAP促进NSCLC细胞的侵袭和转移。抑制METTL3降低YAP m6A修饰可抑制肿瘤生长并增强体内对顺铂的敏感性[63]。此外，另一项研究证明YTHDC2能够抑制肺癌顺铂耐药细胞的增殖和迁移，并通过m6A依赖的Id3增加促进其凋亡，最终抑制肺癌顺铂耐 药。表明YTHDC2是顺铂耐药NSCLC中一种新的肿瘤抑制因子[64]。尚需要更多的研究来揭示特定的m6A调控机制，为临床治疗提供新武器。

克唑替尼是一种靶向c-MET/ALK/ROS1的激酶抑制剂，是治疗具有ALK突变的NSCLC的一线药物。尽管在35%～72%的NSCLC中c-MET过表达，但大多数NSCLC患者对克唑替尼治疗有原发耐药性。西达本胺可以提高NSCLC细胞对克唑替尼的敏感性，通过抑制甲基转移酶METTL3和WTAP的表达，减少c-MET mRNA m6A的甲基化，降低c-MET蛋白水平，随后以c-MET-/HGF依赖性的方式增加NSCLC细胞对克唑替尼的敏感性。对于c-MET高表达或c-MET基因扩增的NSCLC,西达本胺和克唑替尼联合应用可能是一种很有前途的新策略。而siRNA敲低METTL3和WTAP的表达完全消除了西达本胺和克唑替尼的协同作用，西达本胺下调METTL3和WTAP表达的潜在机制值得进一步研究[65]。

3.3 其他作用机制

除上述研究外，m6A在肺癌中还有一些其他作用方式。METTL3靶向EGFR、TAZ、MK2和DNMT3等癌基因，并增强它们的表达，从而增加细胞增殖、存活和侵袭而成为肺癌的癌基因[66]。此外，METTL3 还可以作为阅读器，通过与真核翻译起始因子3的h亚基(eIF3h)直接相互作用来促进肺癌的发展。它们共同促进了含溴结构域蛋白4(BRD4)的过表达，BRD4在癌症的发生、发展过程中发挥着重要的作用[67]。辛伐他汀是治疗高胆固醇血症的一线药物，选择性地抑制了HMG-CoA还原酶途径的限速酶，从而阻断了甲羟戊酸的合成。最近的研究表明辛伐他汀对肿瘤细胞的增殖有抑制作用。肺 癌组织中METTL3 和EZH2上调，辛伐他汀 诱导METTL3下调，通过对EZH2 mRNA的m6A修饰进一步影响EMT,从而抑制了肺癌的恶性进展[68]。至于FTO,尽管存在争议，但很明显，它可以降低其目标mRNA的m6A修饰，包括层粘连蛋白γ2(LAMC2)、血小板反应蛋白1(TSP1)、神经生长因子诱导型(VGF)、整合素α11(ITGα11)以及前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin9型(PCSK9),而促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[69]。另一方面，发现FTO在肺癌中的高表达降低了泛素特异性肽酶7(USP7)的m6A 水平，提高了USP7 mRNA稳定性，并促进了NSCLC的发生[70]。一项回顾性研究中发现FTO在NSCLC细胞系A549中高表达，可能通过降低m6A 水平和激活KRAS信号传导在促进NSCLC中起重要作用，但还需要进一步的研究来揭示FTO的致癌机制[71]。至于ALKBH5,与在胶质母细胞瘤(GBM)中机制相似，ALKBH5过表达通过降低FOXM1中m6A的水平，从而提高了FOXM1 mRNA的翻译效率，不仅促进了胶质瘤干细胞(GSCs)的生长，还促进了LUAD细胞的生长[72,73,74]。另外，发现YTHDF2在肺癌组织中上调，并直接与6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)3' UTR中的m6A修饰位点结合，促进了肺癌细胞中6PGD mRNA的翻译并增强了通过磷酸戊糖途径(PPP)的通量，促进肺癌中的细胞生长[75]。

4、总结与展望

m6A修饰研究的迅速发展标志着分子生物学的重大进展，有助于揭示癌症发生和发展的潜在机制。虽然上述研究已经为我们展示了m6A在肺癌中的部分作用，但要完全理解m6A修改背后的机制还很遥远。而且m6A相关蛋白可能以不依赖m6A的方式影响肿瘤的进展，仍需要我们进一步探索。m6A甲基化在肺癌的发生机制、转移浸润及治疗方案中的关键作用为肺癌的早期诊断、预后预测和治疗提供了新的可能性。并可能为临床分子靶向疗法的研究和开发提供新的目标。

文章来源:冷雪,马建群.m~6A甲基化在肺癌中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(06):1167-1172.