肺癌是全球最常见的肿瘤之一。根据世界卫生组织统计，仅2020年肺癌新发病例数占全球总肿瘤人数的11.4%,占比第二，其死亡率高达18.0%,早期肺癌的5年总生存率仅为10%～20%,其恶性程度和肿瘤转移是目前肺癌患者死亡的主要原因[1]。早发现、早治疗是提高肺癌患者生活质量的有效方法，肺癌早期低分子CT筛查可使死亡率降低39%[2]。虽然近几年临床中使用的新型辅助诊断方式、手术技术的提升、新型研发的分子靶向抑制剂、免疫检查点抑制剂和抗血管生成药物治疗，已经明显改善了肺癌患者的生存结果，使5年生存期从1970年中期的12%增加到 2012 年至 2018 年期间的23%,但其依然是全球死亡人数 最高的癌 症之一[3,4,5]。研究肺癌病因、发病机制、药物和治疗方式等对肺癌患者至关重要。小鼠是肺癌研究中最常用的动物模型，包括诱发性模型、异体移植物模型以及基因工程模型等。虽然各小鼠肺癌模型均无法完全模拟人类肿瘤的复杂性和异质性，可根据不同的研究目的选择适合的小鼠模型，仍可为肺癌的研究提供一些决策性的见解。本文就肺癌小鼠模型相关研究报道进行综述，探讨各小鼠肺癌模型的造模方法、优缺点及应用范围，为肺癌研究中小鼠模型的选择提供参考。

1、小鼠模型的构建

1.1 诱发性模型

诱发性肺癌模型是指：通过使用物理、化学或生物的致癌因素作用于小鼠，诱发小鼠发生肿瘤。该模型常用的小鼠类型有瑞士白化小鼠、A/J小鼠、BALB小鼠、C57BL/6J小鼠和B6C3F1小鼠等。该模型具有诱发因素和诱发条件可控，诱发率高于自然发生率等优点。但是诱发性肺癌模型也具有诱导时间长、诱发药物剂量难以掌控、小鼠死亡率高、肿瘤出现的时间和部位个体差异较大，不易同时获得大量病程一致的动物等缺点。

吸烟、环境污染、职业暴露和慢性肺疾病都已成为肺癌重要发病机制之一[6,7,8],在验证、肿瘤病因及肿瘤预防等相关研究中可使用诱发性小鼠肺癌模型。常用的肺癌诱导的方式有：口服、雾化吸入、皮肤及联合应用等方式。苯并芘是一种多环芳烃，多来源于烟草、汽车尾气、煤和木炭燃料等，是一种很强的致癌物。口服16周苯并芘诱导瑞士白化小鼠发生肺癌，加菠萝蛋白酶联合乙醇橄榄叶提取物降低了肺组织中 TNFα、IL-6 和基质金属蛋白酶的表达，从而减少与炎症和氧化应激相关的BaP诱导的肺癌变，预防慢性炎症导致肺癌[9,10]。研究报道，在苯并芘诱发的肺癌模型中，光敏剂核黄素或维生素B联合氨茶碱可以导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，从而导致大分子物质损伤和细胞凋亡发挥抗癌作用[11,12]。五氧化二钒是另一种与空气污染相关的金属氧化物，可在不同的近交系小鼠中促进肺部肿瘤的发生，主要与五氧化二钒诱导的肺部炎症有关，通过口咽吸入的方式可诱发A/J小鼠、BALB小鼠和C57BL/6J小鼠炎症反应，但其在不同品系小鼠中对慢性炎症相关的趋化因子、转录因子NF-κB和c-Fos以及ERK1/2的持续激活情况不同[13]。目前工程碳纳米管广泛的应用于各种消费品和工业产品，但其包括致癌性在内的潜在的健康危害尚不清楚。研究表明，多壁碳纳米管可促进B6C3F1小鼠初始肺癌细胞的生长和肿瘤进展，表明与碳纳米管相关的职业暴露具有致癌风险，应谨慎使用[13,14]。目前，肺腺癌是诱导性小鼠模型成瘤率最高的肺肿瘤，A/J小鼠通过注射乌拉坦诱发建模成功率基本可达100%,可用于药物评价[15]。通过乌拉坦诱导的FVB/N小鼠肺癌模型评价第二代PGI2类似物曲罗尼尔在小鼠肺腺癌模型中的化学预防作用，发现该药物不能阻止致癌物诱导的肺肿瘤形成，反而能促进小鼠肺肿瘤来源细胞的增殖[16]。N-亚硝基三氯乙基脲(N-nitroso-tris-chloroethylurea, NTCU)以皮肤涂抹的方式可诱导BALB/C小鼠发生肺鳞癌，此模型与人类肺鳞癌具有高度的组织病理学相似性，适合于研究新的促进或抑制肺鳞癌的化学物质[17,18]。

1.2 异体移植物模型

1.2.1 细胞系来源的异体移植模型

细胞系来源的异体移植模型(cell line-derived xenograftmodels, CDX models)是指将肿瘤细胞系植入免疫缺陷小鼠皮下或原位而产生的肿瘤模型(图1)。该模型通常采用免疫缺陷型小鼠，常见的免疫缺陷小鼠有无胸腺裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠等。

CDX模型具有重复性好，成瘤率高、易操作、实验周期短等优点，适用于肿瘤增殖、发生及耐药等相关研究。CDX模型可识别细胞毒性药物，在药物毒性的初步评估、分析耐药机制、靶向治疗药物评估方面有很大应用价值[19]。大多数小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)患者发现时已经是中晚期，预后差，缺乏有效的治疗方法。通过SCLC的CDX模型验证，发现在NK细胞存在时，HDAC6抑制剂和BET溴结构域抑制剂JQ1联合可显著抑制肿瘤的生长，为SCLC的治疗提供一种新型的潜在治疗方法[20]。CDX作为耐药的体外模型，能够以预期的方式获得实验和耐药方法[21]。最新研究中，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)作为SCLC中普遍存在的细胞，可作为“液体活检”样本，提取CTCs植入免疫缺陷小鼠产生的CDX模型，可为药物开发、指导临床决策治疗测试和了解耐药机制提供参考[22]。在靶向药物治疗中，CTCs来源的CDX模型中，与供体患者相关的大量细胞系血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)分析，可以输送药物营养，增加疾病转移，通过血管内皮细胞钙黏连蛋白信号调控VM的表达以及治疗前后活体内血管内皮细胞钙黏蛋白表达细胞的谱系追踪，CTCs为评估肺癌以及其他癌症疾病提供了许多临床相关和有价值的信息，提高肺癌治疗效果，有助于在SCLC中寻找新的药物靶点[22,23,24,25]。

CDX模型存在一定的局限性，该模型不能模拟自然状态下肿瘤发生的过程、肿瘤的多样性和异质性，因此在癌症药物治疗转化为临床环境方面预测能力较差。癌细胞系经多次传代而失去其原有的生物学特性，无法再现肿瘤微环境与先天免疫系统的相互作用，不适用于肿瘤微环境和肿瘤免疫等相关研究。

1.2.2 患者来源异体移植物模型

患者来源异体移植物模型(patient-derived xenograft models, PDX models)是指将患者的新鲜肿瘤组织或肿瘤细胞以原位或异位等方式移植到免疫缺陷小鼠体内建立的肿瘤模型(图1)。常用的小鼠品系有NOD/SCID小鼠、NSG小鼠、NOG小鼠等。该模型保留了原代肿瘤的组织病理学、遗传学特征以及肿瘤异质性，准确再现了患者肿瘤的组织学、分子和体内治疗反应特征，被广泛应用于精准医学、生物标志物预测、疗效评价和肿瘤免疫治疗药物的临床前研究等领域。

1969年，丹麦学者RYGAARD首次成功建立了人源结肠癌肿瘤的PDX模型，但其成功率较低[26]。2002年，日本学者培育出了免疫功能严重缺失的NOG小鼠，2006年美国JACKSON实验室研发出了NSG小鼠，大大提高了PDX模型的成功率[27]。近几十年来，建立了大量PDX肿瘤模型，作为一个强大的工具，PDX模型已广泛的应用于癌症学研究。PDX常用的移植方法有皮下移植、肾包膜移植和原位移植。皮下移植建模成功率高，易于观察肿瘤的生长，但是缺乏血运供应，不易转移；原位移植生长环境更接近肿瘤组织，容易形成转移病灶，需要结合可视化检查方式，但是存在开胸创伤刺激，死亡率较高；肾包膜下移植支持肿瘤生长、浸润和增殖，利于形成转移病灶，在肺癌中被看作更适合的转移模型，但需要精湛的外科技术。联合临床试验(co-clinical trial)是在患者和从临床试验中纳入的患者来源的PDX模型中进行实验，这为开发新的联合治疗、识别预测性生物标志物和深入探索耐药机制提供了一个平台。在肺鳞癌PDX模型中通过联合临床试验，发现表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)可预测肺鳞癌患者对多重激酶抑制剂多韦替尼的药物反应[28]。利用复发小细胞肺癌患者PDX模型评估了三氧化二砷对复发小细胞肺癌的疗效，与二期联合临床试验的临床结果一致[29]。BASCHNAGEL等[30]建立了非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的脑转移瘤PDX模型系统，该模型与患者的原始肿瘤具有很强的的表型和分子相关性，对NSCLC脑转移模型的治疗反应和耐药机制提供了有力的证据。对于PDX建模周期长的问题，近年来MiniPDX是对传统PDX的进一步提升，该模型是体外分离肿瘤细胞并在体内进行药敏试验，可在更短的时间建模成功并指导每位患者个体化治疗[31]。PDX的个体化差异较大，需要可行的评估方式，近年来建立了一系列临床实验中评估个性化的标准：①相关的模型药物反应性评价标准1×1×1实验范例可解决患者的肿瘤生物学问题，PDX模型的最小信息标准(PDX models minimal information standard, PDX-MI)可以评估灵活有价值的最低标准；②以外显子测序和RNA测序评估生长标准化的流程，建立系统的可评估的PDX模型程序；③KuLGaP计算治疗组和对照组的差异，有可能成为量化小鼠模型中药物治疗的首选措施；④PDX Finder作为全球综合开放目录库，模型来源于患者源性移植物储存库、PDXNet和EurOPDX等平台的数据库，根据个体化方式搜索合适的模型，对实验和分析过程中的变化，提供不同程序化操作方案，较为系统提供一些相关参考数据建立PDX模型相关评价体系[32,33,34,35]。

PDX模型具有一定的局限性，携带EB病毒的患者建立PDX模型，淋巴瘤发生率较高，可能与EB病毒感染B细胞在体内存在潜伏期相关，需将异种移植纯化或分选出肿瘤细胞，排除潜在的EB病毒感染白细胞或注射疫苗来避免此问题[36,37]。多次传代后人类基质成分出现鼠化现象，该模型缺乏功能性免疫系统，难以预测免疫药物的疗效，PDX建模时间较长，不能满足临床精准医疗需求，技术难度高，且受多种因素影响，成功率低。

1.2.3 人源化模型

人源化模型是将人类基因、细胞、组织、器官(如人源外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)、人源造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells, HPSCs)、人胚胎肝脏和胸腺等注射到免疫缺陷小鼠宿主体内而产生相关的免疫系统构建的模型(图1)。可选用BRG小鼠、NOG小鼠、NSG小鼠、NRG小鼠等免疫缺陷小鼠。人源化小鼠模型是肿瘤免疫疗法有效工具，在免疫系统人源化小鼠的基础上植入肿瘤细胞或者肿瘤组织，能够更好地模拟人体内的肿瘤微环境。与BRG小鼠相比，NSG和NRG小鼠支持更高水平的人造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)移植和T细胞发育，NSG小鼠支持比NOG小鼠更高水平的骨髓中人类HSC移植。人源化模型为测试疫苗和研究抗原特异性T细胞免疫应答的机制提供了机会，成为转化生物医学研究中越来越重要的工具。

继手术治疗、放化疗与分子靶向治疗后，肿瘤免疫治疗是一种新的能改善癌症患者生存期的治疗方法。将PBMCs注入免疫缺陷小鼠构建Hu-PBL-SCID小鼠形成了一个有效的人类免疫系统来测试人的免疫系统对这种在小鼠模型中生长的多种人类癌症的免疫反应，可作为临床前模型测试免疫检查点阻断(immune checkpoint blackade, ICB)联合疗法对人类癌症的治疗效果[38,39]。将HPSCs注入NSG小鼠体内产生人源化的Onco-HuNSG小鼠，使用诱导多能干细胞获得HPSCs编码糖基转移酶岩藻糖基转移酶6修饰mRNA, E选择素配体缺陷可能是限制骨髓归巢的一个重要因素，对免疫治疗的评估提供更好平台[40,41]。新鲜脐带血提取CD34+干细胞与PDX相结合建立一种改良性人源化PDX模型，模拟人免疫系统和肿瘤微环境，其建模时间较短，没有移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease, GVHD)发生，为免疫治疗的评价提供了一个改进的平台[42]。利用人源 的PD-1小鼠模型进行放射性示踪，发现同位素示踪 剂125I- JS001(托利帕里单抗)可以进行无创监测和指导PD-1阳性肿瘤的肿瘤特异性个性化免疫治疗[43]。

该模型也存在一定局限性，造价昂贵，人的细胞和组织来源缺乏，缺乏人类相关因素和细胞因子在小鼠组织或血浆中循环，在其中一些治疗策略中观察到供体对供体免疫变异性，未分析小鼠亚群中逃避反应的肿瘤群体了解抗药机制[44,45]。

图1 免疫系统构建模型图  

1.3 基因工程肿瘤模型

基因工程小鼠肿瘤模型(genetically engineered mouse model, GEMM)是指运用转基因和基因靶向技术激活致癌基因或灭活肿瘤抑制基因产生的能将遗传改变传递给后代的转基因小鼠模型。常用技术包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases, TALENs)、Cre/loxP系统、CRISPR/CAS技术等。该模型主要用于验证基因功能、识别新的癌症基因和肿瘤生物标志物、深入了解肿瘤起始和肿瘤发生多阶段过程的分子和细胞机制，以及为测试新的治疗策略提供可靠的临产前模型。

在肺腺癌中，RET基因的融合是一种新的致癌驱动基因，其中KIF5B-RET融合最常见。建立可诱导的KIF5B-RET转基因小鼠，可用于KIF5B-RET相关肺腺癌的临床前建模。该模型可用于研究KIF5B-RET激活细胞转化的特定信号通路，发现KIF5B-RET通过多水平激活STAT3信号通路促进非小细胞肺癌的细胞生长和肿瘤发生，为KIF5B-RET阳性肺癌患者的治疗提供了可能的策略[46]。通过KIF5B-RET转基因小鼠肺癌模型发现RET酪氨酸激酶抑制剂可以抑制肺腺癌的发展，甲状腺癌靶向药帕纳替尼可以作为肺腺癌靶向KIF5B-RET及其耐药突变体的有效抑制剂[47,48]。GPRC5A是一种G蛋白偶联受体，在肺组织中表达，但在大多数人类肺癌中受到抑制，Gprc5a基因敲除小鼠是研究肺癌发生和化学预防的新模型，GPRC5A缺乏导致EGFR和STAT3信号通路失调和肺肿瘤发生[49]。通过联合敲除Gprc5a和IL6基因的小鼠模型发现，IL-6在转移性肿瘤细胞中重编程STAT3通路，并诱导骨髓源性抑制细胞的聚集和极化巨噬细胞来逃避宿主免疫，对肺转移前小生境形成和免疫抑制至关重要[50]。K-ras是人类肿瘤中最常见的基因突变，大约有25%左右的肺腺癌患者含有K-ras基因的激活突变，将致癌突变引入到K-ras等位基因中可以模拟人的肺腺癌，该模型小鼠发生肺腺癌的几率可达100%,通过K-ras基因又研发出了可通过Cre介导K-ras等位基因的小鼠模型更容易在肺腺癌中表达[51]。突变的K-ras GEMM小鼠使用显微计算机断层扫描作为药物评估的方式，该模型可作为肿瘤发生发展机制研究及新型药物的治疗潜力评估。

基因工程小鼠模型，使用位点特异性重组酶来控制小鼠基因组中基因表达的空间和时间控制，从疾病的启动、进展、维持角度出发，建造想要的动物模型，考虑了免疫反应，用于预防药物的临床前试验，根据临床前数据预测，预测临床结果和耐药性的机制，缩小临床前数据和试验结果之间差距[52,53]。使用显微计算机断层扫描提出的分析方法能够以高度稳健和高效的方式为GEMM临床前药物研究提供有价值的工具，用于筛选和随机分配动物进入治疗组，并评估肺癌小鼠模型的治疗效果[54]。小鼠医院是用联合临床试验的模式，提供医院环境类型与人类经受享受的治疗，鉴定GEMM对给定治疗方案的敏感性增加或者降低，可以促进对临床参数的实时调整，更方便将数据转换到临床[55]。

转基因动物模型存在一定的限制，成瘤不均一、不能完全模拟人类肺癌，无法高保真模拟组织病理学特性，对于高度特异性的单克隆抗体，可能仅与人体表位发生反应，因此无法对GEMM进行系统性评估。

2、总结与展望

George E.P.Box说“本质上而言，所有模型都是错误的，但是可以尽其所用”。考虑到小鼠和人类之间的显著物种差异，小鼠模型不可能取代对人类肿瘤样本、细胞系和患者的研究，目前还没有一个最完美的模型来研究癌症(表1)。人类癌症研究在识别假定的癌症基因和测试抗癌药物方面非常强大，但它们存在异质性和复杂性，依赖于相关性研究，且难以对肿瘤进过程中的基因功能和机制进行研究。相比之下，小鼠模型在研究基因功能及其在肿瘤进展中发挥作用的机制方面非常有用。然而，它们并不是测试抗癌药物的最佳模型。因此，使用多模型系统的组合方法对于理解人类癌症的复杂性是必要的。小鼠肺癌模型建立方式正在飞速发展，为肺癌研究提供了坚实的基础。随着小鼠模型不断发展和完善，结合自身需求开发模型，可以更好地代表人类生物基因系统，当下被看作是一个个性化医疗和精准医疗的平台。

表1 诱发性模型、异体移植物模型、基因工程小鼠模型优劣势比较

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:31900441);山东省自然科学基金项目(编号:ZR2019MC026);山东省中医药发展计划(编号:2019-0514);

文章来源:于国兴,刘翠兰,张鑫等.肺癌小鼠模型研究进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(07):1361-1366.