非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是中国乃至全球致死率最高的恶性肿瘤之一[1,2]。尽管我们已经在诊断技术和治疗方法上取得了巨大的进步，但由于其侵袭性和抗药性，患者的5年生存率仍然只有15%左右[3]。因此，寻找有效的治疗方法，特别是针对晚期疾病的新型治疗策略，仍然是医学研究的一个重要挑战。

鸢尾素(Irisin)是一种由肌肉分泌的雌激素，最初被认为是通过调节能量代谢来促进“棕色脂肪”的形成[4]。然而，近年来，一系列研究表明，鸢尾素可能具有广泛的生物学效应，包括调节细胞增殖和死亡，调控炎症反应，以及影响神经系统功能[5]。具体到癌症，鸢尾素已被发现能够抑制多种癌症细胞的生长，包括胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌[6,7,8]。有研究显示其在NSCLC中表达降低[9],但其中的机制还未完全阐明。

纳米脂质颗粒(liposomes, LPs)是一种有效的药物输送系统，已被广泛用于各种药物的临床研究和实际应用[10,11]。这些微小的球形结构被用作药物载体，有助于提高药物的稳定性和生物可利用性，同时降低系统性副作用。鸢尾素作为一种新型抗癌药物，其在体内的分布和代谢特性快速，可能存在不稳定性，这些因素可能阻碍了其在肺癌治疗中的应用[12]。为此，我们假设使用LPs作为鸢尾素的药物载体可能会改善这些问题，提高其对非小细胞肺癌的疗效。

在这一假设的基础上，我们进一步关注到鸢尾素可能诱导非小细胞肺癌细胞的铁依赖性细胞死亡(ferroptosis)。铁死亡是一种独特的铁依赖性细胞死亡形式，其主要特征是出现过氧化反应，这是由铁离子催化过氧化脂质形成的[13]。铁死亡过程中，过度的铁离子可以催化脂质过氧化，使线粒体膜发生破裂，导致细胞死亡[14]。此过程中，细胞对活性氧(ROS)的清除效率降低，从而加剧了细胞的损伤[15]。然而，关于鸢尾素诱导的铁死亡的具体机制还未完全明确。Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2)-HO-1(heme oxygenase-1)信号通路在哺乳动物体内起到防御细胞氧化应激的作用[16]。当细胞受到氧化应激时，Nrf2被激活并转移到细胞核中，启动下游一系列基因的表达，包括HO-1。HO-1主要负责降解血红素以产生一氧化碳和游离铁，游离铁会被细胞的铁蛋白结合，避免导致脂质过氧化和细胞损伤[17]。基于此，我们假设鸢尾素可能通过调节Nrf2/HO-1信号通路来诱导肺癌细胞的铁死亡。

我们的研究将首次探索鸢尾素-LPs对非小细胞肺癌的影响，以及其可能的作用机制。我们希望这个研究能够增加对鸢尾素在肺癌治疗中潜力的理解，为开发新型治疗策略提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 化学品和试剂

鸢尾素(Irisin)、胆固醇和氯仿购自Sigma-Aldrich公司(MO,USA)。LPs由Avanti Polar Lipids公司(AL,USA)提供。H1299(非小细胞肺癌)细胞系由American Type Culture Collection(ATCC,VA,USA)提供。CCK8试剂购自碧云天公司(Shanghai, China),JC-1染料以及抗Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A1、Irisin、ACSL4、p53抗体购自Abcam公司(Cambridge, UK)。Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A1、Irisin、ACSL4、p53引物由锐博生物公司提供(Guangzhou, China)。RPMI-1640培养基和RIPA Lysis and Extraction Buffer由Thermo Fisher Scientific(MA,USA)提供，胎牛血清、青霉素和链霉素由Gibco(NY,USA)提供。TRIzol试剂购自于Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)。PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq II来自于Takara(Shiga, Japan)。

1.2 鸢尾素与鸢尾素-纳米脂质颗粒的制备

在制备鸢尾素-纳米脂质颗粒(Irisin-LPs)的过程中，我们首先在室温下将卵磷脂和胆固醇以一定比例混合。接着，我们在氯仿中完全溶解这些混合物以获得脂质溶液。然后，在这个溶液中添加一定浓度的鸢尾素溶液，并通过强力超声(Ultrasonic Processor, 300 w, 5分钟)生成水在油中(W/O)的初级乳液。之后，我们向这个初级乳液中添加超纯水，形成水在油在水中(W/O/W)的二次乳液。乳液在旋转蒸发仪(LabTech EV311H,LabTech, Italy)中进行30分钟的蒸发，以去除有机溶剂。再通过0.45 μm的滤膜对乳液进行过滤，并将其冷藏在4 ℃的环境中储存，以备后续使用。

1.3 透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)分析

1.3.1 纳米脂质颗粒分析

首先，纳米颗粒在室温下稀释至适当浓度。然后，将稀释后的样品施加到200 mesh铜网上，待一段时间以允许粒子吸附。去除多余的液体后，样品被磷酸铵酮盐负染，再用透射电镜进行成像。采集图像并用于颗粒形态和尺寸的统计分析。

1.3.2 线粒体的观察

首先，细胞在适当的条件下处理，然后收集并固定。通常，我们使用2.5%的戊醛和1%的戊二醛在磷酸缓冲液中固定细胞。之后，细胞被脱水、渗透、嵌入，并切成70～90 nm厚的切片。切片放在铜网上，通过透射电镜进行成像。

1.4 包封率(encapsulation efficiency, EE)检测

采用10%的曲拉通，加入到药物脂质体，以裂解脂质体并释放出包封的药物。在进行包封率计算时，首先分离脂质体与游离的药物，分别测定鸢尾素含量，并根据之前得到的鸢尾素标准曲线，计算出包封的药物量和游离的药物量。然后根据公式：包封率(EE)=(Ce/Ct)×100%,计算出鸢尾素-LPs的包封率。

1.5 细胞培养与处理

我们使用的肺癌细胞株H1299从美国ATCC细胞库购买。将H1299细胞在37 ℃,5%CO2的培养箱中培养，使用RPMI-1640培养基进行培养，培养基中含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。对于细胞处理，首先将H1299细胞在6孔板中以5×105的密度接种，并在37 ℃,5%CO2的培养箱中过夜。隔天，用不同浓度的鸢尾素和鸢尾素-LPs处理细胞24小时。

1.6 细胞活性检测

使用CCK8试剂进行细胞活性检测。细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的鸢尾素与鸢尾素-LPs。处理24小时后，按照CCK8试剂说明书进行操作，使用BioTek Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader(BioTek Instruments, Inc.,Winooski, VT, USA)检测OD值。

1.7 流式细胞术检测

1.7.1 细胞凋亡检测

首先，我们采用了FITC标记的Annexin V/丙啶碘(PI)双染法(BD Biosciences, USA)来检测细胞的凋亡情况。在处理之后的24小时，细胞在收集后PBS重悬。随后添加5 μL FITC标记的Annexin V 和5 μL PI。在室温下暗处孵育15分钟后，BD FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)对细胞凋亡进行检测。使用BD FACSDiva软件进行流式细胞仪数据的分析和解读。

1.7.2 细胞周期检测

我们使用了细胞周期检测试剂盒(BD Biosciences)。处理后的细胞被收集、清洗并在室温下修复30分钟，然后与PI/RNase染料液共孵化15分钟，使用BD FACSDiva软件进行流式细胞仪数据的分析和解读。

1.7.3 细胞线粒体膜电位检测

使用JC-1(5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide)线粒体膜电位探针(Thermo Fisher Scientific)来检测线粒体膜电位。处理后的细胞在收集和清洗后以JC-1工作液重悬。在37 ℃,5%CO2环境下孵育20分钟后，使用BD FACSDiva软件进行流式细胞仪数据的分析和解读。

1.8 鬼笔环肽染色

细胞在接种前先在24孔板中放入玻片，随后加入细胞进行爬片。在Irisin或Irisin-LPs处理24小时后，玻片用PBS洗涤2次。在多聚甲醛固定15分钟后，采用0.2%的TritonX-100在4 ℃中通透5分钟。随后根据制造商的说明将渗透好的细胞用PBS洗涤两次，然后加入含有10 μmol/L鬼笔环肽的PBS溶液200 μL(Solarbio, Beijing, China),避光孵育1小时。用PBS洗涤两次后在荧光显微镜进行观察。

1.9 蛋白水平检测

我们使用Western blot法检测蛋白的表达水平。首先，使用RIPA Lysis and Extraction Buffer 进行细胞蛋白的提取，并测定蛋白的浓度。然后，将相等量的蛋白样品在SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳结束后，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上。转膜后在5%BSA中封闭1小时，然后用1∶1 000稀释的一抗在4 ℃过夜孵育。使用的一抗包括：抗Nrf2,抗HO-1,抗GPX4,抗SLC7A1,抗Irisin, 抗ACSL4和抗p53。过夜孵育后，使用1∶5 000稀释的二抗在室温孵育1小时。最后，使用ECL Plus Western Blotting Substrate(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)进行发光检测。使用ImageJ软件进行蛋白条带的灰度值分析，β-actin作为内参。

1.10 mRNA表达水平检测

采用TRIzol试剂按照制造商的指导进行细胞的总RNA的提取。然后使用PrimeScript RT reagent Kit将总RNA反转录成cDNA。cDNA用作SYBR Premix Ex Taq II的PCR反应模板。对于qRT-PCR的反应，我们使用了以下的反应条件：预变性，95 ℃ 30秒；40个循环，包括95 ℃ 5秒，60 ℃ 30秒。所有的反应在ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上进行。在实验中β-actin作为内参，使用2-ΔΔCt法进行数据处理。每个实验重复3次。Nrf2、HO-1、GPX4、SLC7A1、Irisin、ACSL4和p53的引物序列如表1。

1.11 统计学分析

实验结果以平均值±标准差表示，通过IBM SPSS 19.0进行统计学分析。比较两组间的差异，采用独立样本t检验，比较多组间的差异，采 用单因素方差 分析，P值小于0.05为差异有统计学意义。

表1 qRT-PCR使用的引物序列

2、结果

2.1 成功制备并表征鸢尾素与鸢尾素-LPs

我们成功地制备了鸢尾素-LPs, 并通过TEM对其进行了表征。结果显示，鸢尾素-LPs(图1A和C)和NGR修饰的鸢尾素+LPs(图1B和D)都呈现出均一的球形形态，表面褶皱，球体半径大约在500 nm左右。在对梯度浓度的鸢尾素-LPs进行测量后，我们发现包封率均能保持在88%以上(表2),证明了其良好的物理化学性质稳定性。这为后续的肺癌细胞实验提供了重要的实验条件。

图1 TEM分析LPs表征   

表2 封装效率检测

2.2 鸢尾素与鸢尾素-LPs对肺癌细胞的影响

在利用CCK8试验检测鸢尾素和鸢尾素-LPs对肺癌H1299细胞的影响后，我们发现，在经过8小时的处理后，鸢尾素呈剂量依赖性的抑制H1299细胞的活力(图2A)。值得注意的是，鸢尾素+LPs比单独的鸢尾素处理的效果更为明显，而经过NGR修饰的鸢尾素+LPs效果更为显著(图2A)。此外，通过流式细胞术和ELISA分析，我们发现鸢尾素+LPs比单独的鸢尾素有着更高的对H1299细胞的促凋亡(图2B)和细胞周期(图2C)阻滞作用，ROS(图2D)和LDH(图2E)释放量也得到明显提高。这些结果进一步证明了鸢尾素-LPs在抑制肺癌细胞方面的潜力。

图2 鸢尾素对 H1299 细胞活力、凋亡和细胞周期的影响(n=3)   

2.3 鸢尾素和鸢尾素-LPs对肺癌细胞骨架及线粒体的影响

通过鬼笔环肽细胞骨架染色，我们发现鸢尾素和鸢尾素-LPs导致肿瘤细胞骨架着色密度的降低，特别是在鸢尾素-LPs的作用下(图3A)。另外，通过JC-1染色流式细胞术检测结果显示，线粒体的膜电位在鸢尾素处理后显著降低，而在鸢尾素-LPs处理下的降低效果更加显著(图3B)。这些结果揭示了鸢尾素-LPs可能通过影响细胞骨架和线粒体功能来抑制肺癌细胞的生长。

2.4 鸢尾素激活铁死亡途径

由上述结果可知，H1299细胞线粒体在鸢尾素和鸢尾素-LPs作用下产生严重的损伤，因此我们通过超微结构分析探索了与氧化应激和线粒体损伤密切相关的铁死亡途径。通过TEM,我们发现鸢尾素处理后的H1299细胞线粒体表现出明显的铁死亡特征，包括线粒体的明显肿胀以及形状和大小的变化，部分线粒体的嵴甚至变得模糊或消失(图4)。相比于鸢尾素，鸢尾素-LPs处理后的H1299细胞中的铁死亡现象更为明显。这一部分的结果强烈暗示了鸢尾素可能通过激活铁死亡途径来抑制肺癌细胞的生长。

图3 鸢尾素对 H1299 细胞结构形态和线粒体膜电位的影响(n=3)

图4 TEM分析用鸢尾素和鸢尾素-LPs处理H1299细胞后线粒体形态变化  

2.5 Nrf2/HO-1信号在鸢尾素诱导的H1299细胞损伤中的作用

进一步研究鸢尾素诱导的铁死亡过程中，我们发现鸢尾素和鸢尾素-LPs的处理能显著调整多种与细胞死亡相关的信号通路的表达。通过qRT-PCR和Western blot结果显示，与正常H1299细胞相比，鸢尾素和鸢尾素-LPs的处理导致Nrf2、HO-1、GPX4和SLC7A1的表达水平显著降低，Irisin、ACSL4和p53的表达水平显著上升(图5)。这些结果进一步揭示了鸢尾素可能通过调控这些信号通路来诱导肺癌细胞的铁死亡。

3、讨论

尽管近年来针对NSCLC的治疗策略，例如手术、放疗、化疗以及免疫疗法，都在持续进步，但总体预后仍然不尽如人意[18,19]。因此，探寻新的抗肺癌策略和药物对于改善肺癌患者的预后具有极其重要的意义。本研究着眼于鸢尾素以及鸢尾素-LPs对肺癌H1299细胞的影响，希望其结果能为肺癌治疗提供新的视角和可能的策略。

首先，我们成功地制备了鸢尾素-LPs, 并通过TEM进行了表征。鸢尾素-LPs呈现出统一的球形形态，表面褶皱，尺寸约在500 nm左右，且包封率均能保持在88%以上，显示了良好的物理化学稳定性。在探讨其生物效应时，我们发现鸢尾素和鸢尾素-LPs对于抑制肺癌细胞生长、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期以及增强ROS和LDH的释放方面都显示出显著效果。值得一提的是，ROS和LDH的释放是评估细胞受损程度的重要标志—当细胞受到损伤时，这两种物质的释放量通常会显著增加[20]。我们观察到鸢尾素和鸢尾素-LPs能显著增加这两种物质的释放，暗示它们可能通过诱导细胞损伤来达到抗癌效果。此外，鸢尾素-LPs对于诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞的效果比单独的鸢尾素更为显著，这一结果不仅验证了鸢尾素的抗肺癌活性，同时也证实了脂质体作为药物递送载体的有效性，这种载体可以增强鸢尾素的抗癌活性。

深入研究揭示，鸢尾素和鸢尾素-LPs能显著降低肿瘤细胞骨架的染色密度，尤其是鸢尾素-LPs的效果更为显著。细胞骨架是细胞形态的主要支撑者，任何对其结构和功能的影响都可能直接改变肺癌细胞的生长、迁移和分裂[21]。因此，鸢尾素-LPs可能通过影响细胞骨架来抑制肺癌细胞的生长。此外，我们发现鸢尾素和鸢尾素-LPs能显著降低线粒体膜电位，而线粒体膜电位的降低通常与肺癌细胞凋亡和周期相关[22],因此，我们推测鸢尾素-LPs可能通过影响线粒体功能来诱导肺癌细胞凋亡。

鉴于活性氧的积累和线粒体膜电位的降低，我们推测鸢尾素和鸢尾素-LPs的作用可能与铁死亡途径有关。铁死亡是一种独特的细胞死亡形式，其显著特点为铁依赖的脂质过氧化[23]。接下来的TEM分析进一步提供了与铁死亡相关的形态变化的直观证据。具体来说，鸢尾素和鸢尾素-LPs均能引起明显的线粒体肿胀和基质模糊/消失，这是铁死亡的典型表现[24]。鸢尾素-LPs对H1299细胞的损伤更为显著，进一步证实了脂质体作为药物递送载体对于鸢尾素的有效性。

图5 鸢尾素对Nrf2/HO-1信号通路的影响(n=3)   

此外，我们发现鸢尾素和鸢尾素-LPs可以显著调节多种与细胞死亡相关的信号通路的表达，其中包括Nrf2/HO-1信号通路。明确地说，这两种处理方式都可以下调Nrf2、HO-1、GPX4和SLC7A1的表达，并上调Irisin、ACSL4和p53的表达。GPX4(谷胱甘肽过氧化物酶4)和SLC7A1(溶酶体系统A中性氨基酸转运蛋白1)是关键的酶和转运蛋白，它们在防止铁死亡的过程中起着重要作用[25,26]。相反，Irisin、ACSL4(长链酰基辅酶A合成酶家族成员4)和p53的表达水平提高可能与肺癌细胞的死亡有关。Irisin是一种肌肉源性激素，最新的研究表明它在调节铁死亡过程中起作用[27]。ACSL4是一种促进铁依赖性脂质过氧化的酶[28]。而p53是一种肿瘤抑制基因，其活性的增加通常与细胞凋亡和周期相关[29,30]。这些结果进一步证实鸢尾素和鸢尾素-LPs通过调控这些信号通路可以诱导肺癌细胞的铁死亡。尤其是，Nrf2/HO-1信号通路的调控可能是鸢尾素和鸢尾素-LPs诱导肺癌细胞铁死亡的一个重要机制。这可能是因为Nrf2/HO-1信号通路在调控氧化应激反应和维护线粒体功能方面起着关键作用[31],鸢尾素和鸢尾素-LPs的处理可能通过抑制这一通路来增强氧化应激，破坏线粒体功能，从而诱导铁死亡。

总的来说，我们的研究表明，鸢尾素和鸢尾素-LPs通过影响肺癌H1299细胞的多个生理过程，特别是通过触发铁死亡途径和调控Nrf2/HO-1信号通路，有效地抑制了肺癌细胞的生长。这些发现为进一步研究鸢尾素和鸢尾素-LPs作为潜在抗癌药物的机制提供了新的视角，同时为肺癌的治疗提供了新的可能策略，具有重要的临床意义，以提高肺癌的治疗效果和患者的生活质量。

参考文献:

[19]封小红,陶冀.晚期非小细胞肺癌免疫治疗与消融治疗的研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(20):3684-3689.

[30]彭彩霞,王晓峰,王聪.p53抑癌基因在腺样囊性癌中的作用[J].现代肿瘤医学,2016,24(6):1014-1016.

基金资助:广西医疗卫生重点学科建设项目;

文章来源:于志辉,袁斌,诸葛祥真,等.鸢尾素和鸢尾素-纳米脂质颗粒在非小细胞肺癌中的抗癌作用及其机制[J].现代肿瘤医学,2024,32(10):1792-1798.