肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对人类健康造成重大威胁[1]。据报道，每年有160万人死于肺癌，其中近一半病例的组织学类型为非小细胞肺癌，主要包括肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）和肺鳞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC)[2]。尽管肺腺癌治疗取得了一些进展，但不可忽视的是，部分肺腺癌患者确诊时已属中晚期，肿瘤转移是影响肺癌患者生存和整体预后的关键因素[3,4]。研究表明，Snail介导的上皮-间充质转化（EMT）在肿瘤的侵袭转移过程中发挥着关键作用[5]。然而，调控肺腺癌侵袭和转移的机制尚未完全阐明。

Neddylation修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰方式，即将类泛素小分子NEDD8经NEDD8活化酶E1、NEDD8结合酶E2以及NEDD8连接酶E3相继催化并共价偶联到底物分子上的过程[6]。迄今为止，研究最为透彻的neddylation修饰底物是CRL(Cullin-RING Ligase）泛素连接酶超家族[7]。大量研究表明，NEDD8及neddylation修饰的关键酶在多种人类癌症中过表达，并且参与肿瘤的发生发展过程[8]。

哺乳动物细胞中存在两种NEDD8结合酶E2，分别是UBE2M和UBE2F，两者之间存在明显的差异，并具有不同的生物学功能[9,10,11]。UBE2M与RBX1结合并激活CUL1-4，下调UBE2M可引起p21、p27、NOXA等多种抑癌蛋白的积聚，导致细胞周期阻滞、细胞凋亡或衰老，最终抑制肿瘤细胞的增殖[12,13]。相较于UBE2M的广泛研究，UBE2F的报道较少。最近研究发现，UBE2F与RBX2结合可诱导CUL5的neddylation修饰，进而激活CRL5，导致促凋亡蛋白NOXA泛素化降解，从而抑制细胞凋亡[14,15]。然而，CUL5的缺失可以稳定整合素β1，进而促进肺癌转移[16]。因此，UBE2F在肺腺癌发生发展尤其是转移过程中的作用值得进一步研究。本研究旨在探究NEDD8结合酶UBE2F在调控肺腺癌侵袭和转移的机制，为肺腺癌的治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 生物学信息分析

1.1.1 TIMER2.0数据库分析

在TIMER2.0(http://timer.comp-genomics.org/timer/）数据库内，以“UBE2F”作为关键词，输入到肿瘤检索栏内的基因模块中，分析UBE2F在多种肿瘤和正常组织内基因表达情况。

1.1.2 UALCAN数据库分析

借助UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/）数据库，在“TCGA Gene”栏内检索“UBE2F”基因，分析UBE2F在肺腺癌和肺鳞癌中的表达情况。

1.1.3 UBE2F免疫组织化学图像的获取

运用HPA(https://www.proteinatlas.org）数据库，检索“UBE2F”基因，获取正常肺组织的免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色图像，再选择病理图像，获取肺腺癌和肺鳞癌的IHC染色图像。1.1.4生存分析通过Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/）数据库，选定肺癌并且检索“UBE2F”基因，选择总生存期（overall survival,OS）、首次进展生存期（first progression survival,FPS）和进展后生存期（post progression survival,PPS），分析UBE2F与肺癌、肺腺癌和肺鳞癌患者数据的生存相关性。采用Log-Rank检验方法，P<0.05说明基因与疾病生存率显著相关。

1.2 细胞与动物

人肺腺癌细胞系A549和人肾上皮细胞系293T购于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection,ATCC）。雌性裸鼠（6周龄）购于中国南京君科生物工程有限公司，动物许可证号：SCXK（苏）2016-0010。动物实验经台州学院医学院医学伦理委员会批准。

1.3 药物与试剂

高糖DMEM培养基（Basal Media，货号：L110KJ）、10%胎牛血清（Ex Cell Bio，货号：FSP500）和青霉素-链霉素（Basal Media，货号：S110JV）购于上海时置生物科技有限公司。10%PAGE凝胶快速制备试剂盒（货号：PG112）、三色蛋白预染marker（货号：WJ103）、Omni-ECL增强型化学发光检测试剂（货号：SQ101）、TBST缓冲液（货号：PS103S）、PBS缓冲液（货号：PS110S）、Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液（货号：PS105S）和转膜缓冲液（货号：PS109S）购于上海雅酶生物医药科技有限公司。Cullin1抗体（Abcam，货号：75817）、Cullin5抗体（Abcam，货号：184177）、UBE2F抗体（Abcam，货号：12932）、Snail抗体（Cell Signaling Technology，货号：3879）和β-actin抗体（Cell Signaling Technology，货号：3700）购于上海艺维生物科技有限公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠Ⅱ抗（货号：BK-RO50）及HRP标记的山羊抗兔Ⅱ抗（货号：BK-MO50）购于杭州宝科生物科技有限公司。脱脂奶粉（货号：232100）购于美国BD公司。PVDF膜（货号：IPVH00010）购于美国Millipore公司。环己酰亚胺（cycloheximide,CHX)(Cell Signaling Technology，货号：2112）购于上海索莱宝生物科技有限公司。Transwell小室（货号：3422）购于美国康宁（Corning）公司。细胞RNA快速提取试剂盒（货号：B004D）购于美国EZ-Bioscience公司。逆转录试剂盒（货号：RR047A）和RT-PCR试剂盒（货号：RR420A）购于日本Ta Ka Ra公司。Lipofectamine3000（货号：L3000015）购于美国Invitrogen公司。聚凝胺（货号：C0351）、嘌呤霉素（货号：ST551）、4%多聚甲醛（货号：P0099）、结晶紫染色液（货号：C0121）购于碧云天生物科技有限公司。

1.4 仪器

荧光化学发光成像仪（美国GE公司，型号：Amersham Imager 680),Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：Step One Plus），倒置显微镜（日本Olympus公司，型号：IX73P2F），垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：Power Pac系列），转印槽（美国Bio-Rad公司，型号：Mini Trans-Blot），移液器（德国Eppendorf公司，型号：3123000012），电热恒温水槽（上海森新实验仪器有限公司，型号：DK-8D），轨道式摇床（杭州米欧仪器有限公司，型号：GS-10），翘板摇床（杭州米欧仪器有限公司，型号：HS-25），恒温金属浴（上海一恒科技有限公司，型号：TU-100），电子天平[赛多利斯科技仪器（北京）有限公司，型号：BSA623S-CW]。

1.5 方法

1.5.1 细胞培养

肺腺癌A549细胞在温度为37℃、含5%CO2的培养箱培养，DMEM培养基内添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗。

1.5.2运用CRISPR/Cas9技术构建UBE2F敲除的稳定A549细胞系

为了构建UBE2F敲除的慢病毒载体，将两条针对UBE2F的RNA引导序列插入到Lenti-guide-puro载体中。通过Lipofectamine3000将Lenti-guide-puro载体（4μg）、包装载体AGP091(3.0μg）和AGP090(1.2μg）共转染293T细胞，转染48 h后，收集病毒上清液，过滤并且与聚凝胺混合以提高转染效率。接着使用病毒感染A549细胞，并使用10μg/m L嘌呤霉素筛选5 d。

1.5.3 动物实验（裸鼠肺腺癌转移瘤模型）

将裸鼠随机分为3组，其中一组为对照组（Control），尾静脉注射未做处理的A549细胞；另外两组为UBE2F敲除组（UBE2F-KO1、UBE2F-KO2），尾静脉注射UBE2F敲除的A549细胞，分别饲养2周后，处死小鼠解剖收集小鼠肺组织样品，放入中性福尔马林固定液固定后，计数肺表面转移的小结节数目。尾静脉注射的细胞数量为2×106个/只。

1.5.4 细胞划痕试验

将对照组和两组UBE2F敲除的细胞铺板至6孔板。次日，借助直尺定位，使用枪头从6孔板一端划至另一端。无血清培养基清洗2次，加入无血清培养基，放至培养箱内孵育24 h，在倒置显微镜下，拍照观察并且测量距离。

1.5.5 Transwell小室迁移和侵袭试验

利用无血清培养基将5×104个各组细胞接种至transwell小室内，取600μL含有10%胎牛血清的培养基加入24孔板的下室，在37℃下培养4 h（转移）或12 h（侵袭）后，去除培养液，加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，移去多聚甲醛后加入0.1%结晶紫染色30 min，移去结晶紫后使用PBS缓冲液轻轻冲洗数次，晾干后在倒置显微镜下拍照并计数。（在侵袭实验中，小室涂有Matrigel涂层）。

1.5.6 Western blot检测蛋白表达

取出处理后的细胞，使用RIPA裂解液提取总蛋白，100℃金属浴加热10 min变性。经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，经200 m A恒流90 min转膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，封闭结束后用TBST缓冲液洗3次，每次时间10 min，加入一抗于4℃冰箱中孵育过夜，回收一抗后TBST缓冲液洗3次，每次时间10 min，加入二抗于室温下孵育2 h，移去二抗后使用TBST缓冲液洗3次，每次时间10min，最后在ECL化学发光试剂成像仪内检测蛋白表达。使用Amersham Imager 680软件进行半定量分析。

1.5.7 CHX追踪测定法检测Snail蛋白质半衰期

CHX追踪测定法实验采用50μg/m L CHX在指定时间点处理细胞，并通过Western blot分析测定Snail蛋白的半衰期。

1.5.8 Real time PCR检测Snail m RNA的表达

从培养箱中取出细胞，根据细胞RNA快速提取试剂盒的说明提取总RNA，接着根据Takara逆转录试剂盒的说明取1μg总RNA进行逆转录反应，最后根据Takara real time PCR试剂盒的说明进行Real-time PCR反应。反应条件如下：95℃预变性30 s,95℃反应5 s,60℃反应30 s，共计40个循环。在Primerbank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）上设计引物，具体序列如下：Human Snail:5'-ACTGCAACAAGGAATACCTCAG-3'（正义链），5'-GCACTGGTACTTCTTGACATCTG-3'（反义链）。Snail的相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.6 统计学方法

本实验的所有数据均以至少3个独立实验的均数±标准差表示。使用Graph Pad Prism 5软件进行统计分析。采用非配对双尾t检验对两组数据进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 UBE2F在肺腺癌中高表达

利用TIMER 2.0数据库在线分析UBE2F在不同肿瘤中的表达情况。结果发现，与正常组织相比，UBE2F在肺腺癌和肺鳞癌中高表达（Fig.1A）。另外，通过UALCAN数据库和HPA数据库分析发现，UBE2F在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达情况高于正常组织（Fig.1B-C）。以上结果均表明UBE2F在肺癌中高表达。

2.2 UBE2F在肺腺癌中高表达提示预后良好

为了阐明UBE2F表达在肺癌患者中的临床意义，我们使用Kaplan-Meier Plotter数据库对肺癌、肺腺癌和肺鳞癌患者数据进行生存分析。UBE2F高表达肺癌患者的OS、FPS和PPS均优于UBE2F低表达肺癌患者（OS:P=0.000 19,HR=0.76;FPS:P=0.029,HR=0.79;PPS:P=0.002 5,HR=0.64）；特别是，肺腺癌患者中UBE2F高表达的预后显著优于UBE2F低表达的预后（OS:P=3.7e-5,HR=0.6;FPS:P=0.039,HR=0.73;PPS:P=0.006 2,HR=0.56）。然而，在肺鳞癌患者中，UBE2F的表达水平与患者预后无显著相关性（OS:P=0.84,HR=0.98;FPS:P=0.47,HR=0.86;PPS:P=0.67,HR=0.88)(Fig.2A-C）。综上所述，UBE2F在肺腺癌患者中高表达预示着更好的预后。

2.3 UBE2F缺失促进肺腺癌转移

与对照组相比，UBE2F敲除组下调了UBE2F的表达，并伴随着CUL5的neddylation修饰水平的降低，但对neddylation修饰中的经典底物CUL1的neddylation修饰水平基本保持不变（Fig.3A）。以上发现表明，下调UBE2F能有效地抑制CUL5的neddylation修饰水平。

通过尾静脉将对照组和UBE2F敲除组的A549细胞系注射到小鼠体内，40 d后收取小鼠肺组织，统计小鼠肺组织表面上转移的小结节数目。结果显示，与对照组相比，UBE2F敲除组肺组织表面上转移的小结节数目显著增多（P<0.05)(Fig.3B）。以上结果表明，UBE2F缺失可明显促进肺癌转移，提示UBE2F在肺腺癌转移中具有重要作用。

2.4 UBE2F缺失促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭

与对照组相比，UBE2F缺失能明显提高肺癌细胞的迁移能力（P<0.05)(Fig.4A-B）。此外，Transwell侵袭和迁移实验同样表明，敲除UBE2F可显著提升肺腺癌细胞的侵袭和迁移能力（P<0.01)(Fig.4C-F）。以上结果表明，UBE2F缺失促进肺腺癌细胞迁移和侵袭。

2.5 UBE2F缺失上调Snail

Western blot检测发现，与对照组相比，敲除UBE2F可上调Snail的蛋白表达水平（Fig.5A）。Real time PCR检测发现，敲除UBE2F显著上调Snail的m RNA水平（P<0.01)(Fig.5B），并延长Snail蛋白的半衰期（Fig.5C）。本研究结果进一步证实UBE2F缺失不仅可激活Snail的转录，还可以抑制Snail的蛋白降解，从而导致其积聚。综上所述，UBE2F缺失通过促进Snail转录同时抑制Snail蛋白降解，协同导致Snail积聚进而促进肺腺癌侵袭和转移（Fig.6）。

3、讨论

肺癌是最常见的人类恶性肿瘤之一。其中，肺腺癌是最常见的肺癌类型，而转移是导致肺腺癌患者预后差的主要原因[1,12]。肺腺癌的转移是一个多方面的过程，涉及一系列细胞生物学变化。现有研究发现，EMT与肿瘤的恶性表型密切相关，包括肿瘤的侵袭和转移[17]。在EMT转录因子中，Snail在肿瘤转移中起着关键作用[17,18,19,20]。然而，促进肺腺癌细胞迁移和侵袭的调控机制尚未完全阐明[13,21]。通过多个数据库分析发现，NEDD8结合酶UBE2F在肺腺癌中高表达，并且其高表达预示着更好的生存率。机制上，UBE2F通过下调EMT转录因子Snail抑制肺腺癌转移。本研究不仅揭示了肺腺癌转移的机制，而且为转移性肺腺癌的治疗提供了新的思路。

Neddylation修饰是将类泛素小分子NEDD8与底物蛋白上的赖氨酸残基共价偶联的过程。近期研究表明，NEDD8关键酶（例如：E1:NAE1和UBA3;E2:UBE2M和UBE2F等）在多种肿瘤中过表达，并且neddylation修饰的关键酶可能参与肿瘤的发生发展[20,22]。研究发现，两种NEDD8结合酶UBE2M和UBE2F分别行使着不同的生物学功能。UBE2F负责介导CUL5的neddylation修饰，UBE2M负责介导CUL1/2/3/4的neddylation修饰[10]。已有研究表明，UBE2F-CUL5复合物可能在肺癌中表现出双重功能。一方面，UBE2F被认为是一种抗凋亡蛋白，其高表达促进CUL5的neddylation修饰，导致促凋亡蛋白NOXA的多泛素化降解，从而促进肺癌的生长[14,22]。另一方面，有研究表明，CRL5-E3复合物的重要组分CUL5和SOCS3缺失，通过稳定整合素β1和刺激整合素β1下游信号通路，包括FAK和SRC，从而促进肺癌转移[16]。本研究结果进一步支持了CRL5-E3复合体中的UBE2F可通过调节Snail表达抑制肺癌转移的观点。以上发现表明，UBE2F可能在肺腺癌中发挥着双重作用，它既可以促进肿瘤生长，又可以抑制EMT进程从而阻断肿瘤转移。事实上，具有双重功能的蛋白在肿瘤研究中也不乏报道，且已被证明可能是肿瘤发生发展中的一种普遍现象[23,24,25,26,27,28]。例如，F-box蛋白22(FBXO22）在乳腺癌的生长和转移中具有类似的作用。FBXO22在乳腺癌中过表达，促进乳腺癌细胞的增殖；同时，FBXO22通过降解Snail抑制EMT，进而抑制乳腺癌的侵袭转移[28]。然而，UBE2F从肿瘤生长因子转变为肿瘤转移抑制因子的机制和原因有待进一步研究。

本研究存在一些局限性。首先，UBE2F与EMT其他相关蛋白之间的关系还有待进一步验证。其次，UBE2F调控Snail蛋白降解和转录水平的具体机制有待进一步研究。总之，本研究表明UBE2F可以通过抑制转录和促进蛋白质降解来下调Snail，激活UBE2F可能成为改善肺腺癌预后的新希望。

参考文献:

[21]眭玉霞,庄捷,庄敏,等. Delicaflavone通过PI3K/AKT/mTOR通路调控上皮-间质转化抑制吉非替尼耐药肺癌PC-9/GR细胞迁移和侵袭[J].中国临床药理学与治疗学, 2022, 27(6):614-621.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81871870;82073069);

文章来源:林雄智,张路易,贺连平,等.NEDD8结合酶UBE2F调控肺腺癌转移的分子机制研究[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(06):612-620.