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固相萃取-UPLC/MS/MS法测定食品中黑豆红含量

2020-07-14 215 上传者：管理员

摘要：研究建立测定食品中黑豆红含量的固相萃取-UPLC/MS/MS分析方法。样品经调节pH值、离心等前处理后，通过聚酰胺固相萃取小柱的富集、净化、浓缩，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱分离，经ESI源(+)电离，多反应监测(MRM)定性和定量。实验结果表明，该方法检出限为0.2mg/kg，回收率为87%-105%；线性范围为0.10μg/mL-100.0μg/mL，相关系数为0.9996，相对标准偏差为2.5%-7.6%(n=6)。本方法准确度高，选择性好，灵敏度高，具有较好的重现性和精密度，可用于食品中黑豆红含量的定性和定量分析。

关键词：
分析化学
固相萃取
液质联用
黑豆红
黑豆红色素
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黑豆红色素是以黑豆种皮为原料提取的天然色素，为类黄酮类化合物，属于花青素苷类色素，包括矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷，其中主要成分是矢车菊素-3-半乳糖苷，是一种很有应用价值的天然色素[1,2]。我国现行的国家标准GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定黑豆红可用于果蔬汁（浆）类饮料、风味饮料（仅限果味饮料）、配制酒、糖果、糕点上彩装等产品，在这些产品中最大使用量均为0.8g/kg[3]。

黑豆红和其他种类的花青素性质相似，容易受到光、酸碱性、金属等影响，pH值越高越不稳定,具有一定的耐热性[4,5]，而关于矢车菊素-3-半乳糖苷的检测方法，目前常用的有pH示差法、紫外-可见分光光度法[6]、高效液相色谱法[7,8,9]和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法[10,11]；其中超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法比其他方法在快速分离、准确性、选择性和灵敏度等方面更具有优势[12]。而利用固相萃取小柱能够对目标分析物进行富集、净化、洗脱，达到富集去干扰的净化效果。因此采用固相萃取-UPLC/MS/MS法可以对食品中黑豆红含量进行定性定量分析。

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

Agilent1290-6460超高效液相色谱-三重四极杆液质联用仪，配有JetstreamESI源（美国Agilent公司）、电子天平（梅特勒托利多）、固相萃取装置（美国milli公司）、氮吹仪（北京康林）、高速离心机（湖南湘仪）、超纯水机（湖南科尔顿）、黑豆红标准品（TorontoResearchChemicals）、甲醇（HPLC级，DIKMA）、甲酸（HPLC级，DIKMA）、聚酰胺固相萃取小柱（poly-seryPA1g/6mL上海安谱）；实验室用水均来自一级水系统。

1.2试剂与标准溶液配制

0.1%甲酸水溶液：取0.25mL甲酸于250mL容量瓶中，加纯水至刻度，经0.22μm滤膜过滤。

0.5%甲酸水溶液：取2.5mL甲酸于500mL容量瓶中，加纯水至刻度。

0.5%甲酸甲醇溶液：取0.500mL甲酸于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度。

黑豆红标准储备液配制：准确称取黑豆红标准品0.00200g（精确至0.01mg）于10mL棕色容量瓶中，用0.5%甲酸甲醇溶解并定容至刻度，配制成200μg/mL标准储备液，保存于-18℃冰箱中。

黑豆红标准工作液配制：分别准确吸取黑豆红标准储备液0μL、2.5μL、25μL、125μL、250μL、500μL、1000μL、2500μL于8个5mL棕色容量瓶中，并用0.5%甲酸甲醇定容至刻度。配制成浓度分别为0μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、100.0μg/mL标准溶液工作液。黑豆红标准溶液TIC图见图1。

图1浓度为5.0μg/mL黑豆红标准溶液TIC图

1.3仪器条件

1.3.1色谱条件

流动相A:0.1%甲酸溶液；流动相B：甲醇；色谱柱：AgilentRX-sil1.8μm*50mm*2.1mm流速：0.3mL/min进样量：2μL、柱温：30℃。梯度洗脱条件见表1。

1.3.2质谱条件

离子源：JetstreamESI源，正离子模式，多反应监测扫描方式（MRM）；干燥气温度：325℃；干燥气流速：12L/min；雾化气压力：35psi；鞘气温度：400℃；鞘气流速：12L/min；毛细管电压：4000V；多反应监测模式MRM参数见表2。

表1梯度洗脱

表2黑豆红MRM参数

备注：带*号为定量离子

1.4实验方法

1.4.1样品前处理

1.4.1.1果味饮料

准确称取1.0g（精确至0.1mg）样品于烧杯中，（碳酸型果味饮料需先经超声波振荡5min，以去除CO2），用甲酸调节其pH=3，待用。

1.4.1.2果蔬汁饮料

准确称取1.0g（精确至0.1mg）样品于离心管中，用甲酸调节其pH=3，必要时可经过10000r/min离心10min，取上清液待用。

1.4.1.3糖果

经研钵研磨粉碎后，准确称取1.0g（精确至0.1mg）样品于烧杯中，加纯水20mL，经50℃水浴温热搅拌溶解后，放冷，用甲酸调节其pH=3，转移并定容至25mL，摇匀后，取2mL待用。

1.4.1.4配制酒

准确称取1.0g（精确至0.1mg）样品于烧杯中，经50℃水浴以去除酒精含量，放冷，用甲酸调节其pH=3，待用。

1.4.2固相萃取小柱净化

依次用5mL甲醇、5mL纯水、5mL0.5%甲酸-水活化聚酰胺小柱，取上述提取液上样，缓慢过柱，接着用5mL0.5%甲酸-水分两次淋洗，可利用重力作用自行过柱，最后用5mL甲醇进行洗脱，经氮气吹近干，用0.5%甲酸-甲醇溶液定容至5mL，摇匀后，经0.22μm滤膜过滤，上机。整个操作过程注意避光，同时避免与任何金属材料接触。样品TIC图见图2。

图2果汁样品TIC图

2、结果与讨论

2.1色谱柱的选择

根据实验室现有的色谱柱类型，选择了型号规格均为1.8μm*50mm*2.1mm的Agilentporoshell120EC-18、AgilentRX-sil、AgilentEclipseplusc18、Agilentsb-c18四种类型色谱柱进行测试，测试结果表明，Agilentporoshell120EC-18、AgilentEclipseplusc18、色谱柱柱效偏低，且峰宽过大，响应不高。而AgilentRX-sil和Agilentsb-c18色谱柱相对来说响应高了许多，峰形也有所改善，而且可以耐较低pH,Agilentsb-c18色谱柱在峰形上有点分叉，而AgilentRX-sil色谱柱在平衡时间上所需要的时间较长。综合考虑，选用对于亲水性可电离化合物色谱行为较好的AgilentRX-sil色谱柱较为合适。

2.2流动相体系的选择

选取了甲醇+水=5+95、甲醇+0.1%甲酸水=5+95、乙腈+0.1%甲酸水=5+95、0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水=5+95四种流动相体系。实验结果表明：流动相体系为甲醇+水=5+95时，响应很低，峰形很不好，拖尾严重，而采用其他三种加酸的流动相时，响应高，峰形好，相对而言甲醇+0.1%甲酸水=5+95响应值比乙腈+0.1%甲酸水=5+95高，与0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水=5+95差别不大，主要是因为在酸性条件下可以增加黑豆红的溶解性和电离性，在质谱参数摸索中，发现采用正离子模式比负离子模式效果更好，加酸刚好也符合正离子模式的需要。而0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水作为流动相的实验结果也可行，考虑到色谱柱耐酸性的影响，所以选择甲醇+0.1%甲酸水=5+95作为流动相最为合适。

2.3质谱参数的优化

根据黑豆红分子结构特征，采用电喷雾正离子模式下，对干燥气温度、干燥气流速、雾化气压力、鞘气温度、鞘气流速、毛细管电压等质谱参数进行优化，在确定母离子m/z449.1后，再对母离子进行子离子扫描，从而得到子离子m/z282.2和m/z137.1；根据响应丰度的不同，选择m/z282.2为定量离子，m/z137.1为辅助定性离子；通过仪器自带的MassHunterOptimizer优化软件对Fragmentor和CE两个参数进行优化，从而得到了MRM参数，见表2。采用该MRM参数对待测样品进行定性定量分析。黑豆红MRM扫描质谱图见图3。

图3黑豆红标准品MRM扫描质谱图

2.4标准曲线、线性范围、检出限

依据优化好的液相条件和质谱参数进行测定，以定量离子m/z282.2丰度对质量浓度做标准曲线，得到线性回归方程为：y=69148.6x-28145.8，相关系数为：0.9996，表明在0.10μg/mL-100.0μg/mL线性范围内线性关系良好，能满足检测要求。以3倍信噪比S/N计算得到检出限为0.2mg/kg。

2.5方法精密度、回收率

分别称取同一样品6份，按上述方法进行提取、净化、上机等步骤，得到相对标准偏差为：2.5%-7.6%(n=6）；同时进行加标回收试验，得到回收率为87%-105%，结果表明，方法准确性较高，重复性较好。

2.6配制标液所用溶剂的选择

根据文献资料，可知黑豆红在酸性条件比较稳定，在0.1%HCl-甲醇溶液下，黑豆红最为稳定，考虑到盐酸具有很强的挥发性和腐蚀性，容易对质谱造成损伤，选用甲酸来调节溶剂的pH较为合适，分别选择纯水、甲醇+水=3+7、pH=3甲醇-水溶液=3+7、pH=5甲醇-水溶液=3+7、甲醇+甲酸=6+4、0.5%甲酸-甲醇溶液，0.1%甲酸-甲醇溶液进行实验观察，同一浓度下响应值见表3，实验结果表明在酸性条件下有利于黑豆红电离，同时在0.5%甲酸-甲醇溶液响应值较高。